高致病性2型豬鏈球菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)分子的篩選與功能研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis, S.suis)為革蘭陽性球菌,根據(jù)其莢膜多糖的差異可以分為35個血清型,其中2型豬鏈球菌(S.suis2,SS2)致病力最強,分布最為廣泛。SS2是一種重要的人畜共患病原體。它的主要感染宿主是豬,SS2感染現(xiàn)已成為最為重要的豬傳染病之一,每年給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外,SS2還能通過傷口和呼吸道等傳播途徑感染人,引起急性腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等。因此,也對相關(guān)從業(yè)人員

2、的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。既往報道人感染SS2病例多為散發(fā),但1998年和2005年我國江蘇和四川先后暴發(fā)兩起大規(guī)模人群SS2感染疫情,部分感染病人短期內(nèi)出現(xiàn)高熱、低血壓休克、多器官功能衰竭等癥狀,病情極為兇險,病死率極高,為國內(nèi)外首次報道的由非 A群鏈球菌引起的大規(guī)模鏈球菌中毒性休克綜合征(streptococcal toxic shock syndrome,STSS),給公共衛(wèi)生安全帶來了極大的威脅。
　　SS2致病機(jī)制較為復(fù)雜

3、,至今尚未完全闡明。陳晨等人通過比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn),引起我國兩次暴發(fā)流行的代表菌株98HAH12和05ZYH33與SS2標(biāo)準(zhǔn)菌株相比,高致病性SS2含有一個89K毒力島(pathogenicity island, PAI),相關(guān)研究結(jié)果高度提示該毒力島與流行菌株的高致病性密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),89K毒力島的5’端含有一段編碼Ⅳ型分泌系統(tǒng)(TypeⅣ secretion system,T4SS)的基因簇。T4SS廣泛分布于革蘭陰性

4、細(xì)菌和陽性細(xì)菌,它能夠介導(dǎo)效應(yīng)分子的跨膜轉(zhuǎn)運,并將其分泌至宿主細(xì)胞或胞外環(huán)境,參與細(xì)菌的致病過程。本課題組前期研究結(jié)果提示,高致病性SS2的T4SS很可能通過分泌某種效應(yīng)分子,參與細(xì)菌的致病過程,引發(fā)STSS。因此,找到T4SS的效應(yīng)分子并對其功能進(jìn)行深入研究,對于闡明高致病性SS2引發(fā)STSS的機(jī)制具有重要意義。
　　為此,本課題首先通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),尋找SS2野生株與T4SS關(guān)鍵組分缺失突變株的差異分泌蛋白,篩選出 T4SS

5、的效應(yīng)分子。然后分別在轉(zhuǎn)錄水平、效應(yīng)蛋白分泌水平以及蛋白質(zhì)相互作用水平對效應(yīng)分子 SspA進(jìn)行了驗證。最后通過構(gòu)建效應(yīng)分子基因缺失突變株,觀察其對細(xì)菌毒力以及刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥因子的能力的影響。主要實驗內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.T4SS效應(yīng)分子的篩選:TCA-丙酮沉淀法獲得 SS205ZYH33野生株以及 T4SS關(guān)鍵組分基因缺失突變株培養(yǎng)上清中的分泌蛋白。通過LC-MS/MS技術(shù),應(yīng)用質(zhì)譜鳥槍法(shot-gun)策略鑒定上清分泌

6、蛋白,獲得兩株細(xì)菌的分泌蛋白譜,通過分析比較尋找差異蛋白,從而篩選出T4SS相關(guān)的可疑分泌蛋白即候選的效應(yīng)分子。在本實驗中,我們篩選到了7個候選效應(yīng)分子。7個候選效應(yīng)蛋白中包括兩個類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶(SspA),三個ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)蛋白,一個脯氨酰-tRNA合成酶以及一個假定蛋白。根據(jù)文獻(xiàn)報道和實際情況我們選擇了其中得分最高的05SSU1982蛋白(SspA)進(jìn)行了深入的研究。
　　2.效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄水平的驗證:提取對數(shù)后期S

7、S2野生株05ZYH33和T4SS關(guān)鍵組分缺失突變株(virD4、virB1以及virB4) mRNA,通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR的方法對各菌株sspA基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較。結(jié)果表明各菌株 sspA基因的轉(zhuǎn)錄無顯著差異,說明在 T4SS關(guān)鍵組分缺失的突變株培養(yǎng)上清中檢測不到 SspA的分泌并不是由于T4SS組分的缺失影響了sspA基因的轉(zhuǎn)錄。
　　3.效應(yīng)分子分泌水平的驗證:通過大腸桿菌、pET28a表達(dá)系統(tǒng)以及鎳親和層析、離子交換層

8、析的純化方法表達(dá)純化含SspA主要結(jié)構(gòu)域片段的重組蛋白,然后用獲得的純度較高的蛋白免疫小鼠,制備含SspA多克隆抗體的免疫血清,最后通過該免疫血清檢測比較SS2各菌株分泌上清中的效應(yīng)分子SspA,Western blot結(jié)果證實T4SS介導(dǎo)了效應(yīng)分子SspA的分泌,與質(zhì)譜檢測結(jié)果吻合。
　　4.T4SS組分VirD4與效應(yīng)分子SspA相互作用的驗證:通過pGEX-6p-1載體表達(dá)純化GST-VirD4融合蛋白,并以它作為誘餌,通過

9、Pull-down實驗驗證它與效應(yīng)分子SspA之間是否存在相互作用。結(jié)果證實SspA蛋白與 T4SS效應(yīng)分子偶聯(lián)蛋白VirD4之間存在直接的相互作用,也是SspA蛋白作為T4SS效應(yīng)分子的有力證據(jù)。
　　5.T4SS效應(yīng)分子的功能研究:運用基因同源重組技術(shù)構(gòu)建 sspA基因缺失突變的SS2,對效應(yīng)分子SspA的功能進(jìn)行研究。通過BALB/c小鼠感染模型證實了 sspA基因缺失的SS2對小鼠的致病性減弱,同時,ELISA炎癥因子檢測

10、實驗表明效應(yīng)分子基因缺失突變株刺激小鼠產(chǎn)生炎癥因子的能力大大降低。
　　綜上所述,本研究通過蛋白組學(xué)方法篩選出了 T4SS的效應(yīng)分子。并分別在轉(zhuǎn)錄水平、效應(yīng)蛋白分泌水平以及蛋白質(zhì)相互作用水平對其進(jìn)行了驗證,證實了SspA蛋白確為T4SS的效應(yīng)分子。最后通過構(gòu)建sspA基因缺失突變株以及動物攻毒實驗證實了sspA基因缺失的SS2對小鼠的致病性減弱以及刺激小鼠產(chǎn)生炎癥因子的能力大大降低。說明T4SS效應(yīng)分子SspA能夠誘導(dǎo)小鼠炎癥因子