家雞囊胚細(xì)胞嵌合體技術(shù)研究及應(yīng)用.pdf

1、據(jù)常規(guī)嵌合體模型原理,利用具有"十全"特征的地方黑絲毛烏雞,提出多表現(xiàn)型遺傳標(biāo)記嵌合體模型的概念,并應(yīng)用于嵌合體檢測;通過對囊胚的分離與消化、赤道面開窗、不換殼培養(yǎng)以及供體BCs的轉(zhuǎn)移等一系列嵌合體制作技術(shù)的研究,建立家雞BCs嵌合體批量制作技術(shù);結(jié)合新型GFP報告基因,研究以BCs嵌合體為手段的家雞外源基因?qū)胪緩?此外,基于BCs嵌合體種系檢測的困境和同型嵌合體與種系嵌合率的關(guān)系,探索家雞w染色體PCR性別鑒定技術(shù)在此領(lǐng)域的應(yīng)用.結(jié)

2、果顯示:①絲毛可作為家雞家雞嵌合體除黑羽以外的又一個表現(xiàn)型遺傳標(biāo)記,但絲羽發(fā)生嵌合的難度更高.②利用受體種蛋赤道面開窗、蛋殼切塊復(fù)原、不換殼培養(yǎng)等改進(jìn)的囊胚細(xì)胞嵌合體制作技術(shù),實驗組最高出殼率為40％(29/73),據(jù)表現(xiàn)型判斷,出殼的嵌合體率18％(13/73),嵌合體胚26％(19/73).其中黑膚、毛腳、五趾、黑喙等供體特征也不同程度地出現(xiàn)在嵌合體雛雞中.③經(jīng)嵌合體種系傳遞檢測,嵌合體♂×烏骨雞♀的測交組合,7只嵌合體公雞中有6號

3、、8號、11號、12號能分別產(chǎn)生比率為2.5％(3/118)、31.6％(6/19)、71.4％(15/21)、33.3％(18/54)的黑羽特征(羽色嵌合體模型意義上的種系嵌合體)后代.而且6號、8號、12號還得到了1.7％(2/118)、10.5％(2/19)、1.8％(1/54)的有"十全"特征(羽色和羽形嵌合體模型意義上的種系嵌合體)后代.嵌合體♀×烏骨雞♂的測交組合中,獲得黑羽、純?yōu)豕请u特征率分別為29.4％(35/119)、

4、1.7％(2/119).飼養(yǎng)至720d,有2只嵌合體公雞和所有3只嵌合體母雞仍保持了最初的各種嵌合體特征.④BCs在體外培養(yǎng)4h后,用pEGFP-C1質(zhì)粒與脂質(zhì)體(1mg/mL)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,參數(shù)為:脂質(zhì)體5μL,質(zhì)粒DNA 1.5μg,細(xì)胞密度為4個胚,脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合物時間為30min,BCs與脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物共培養(yǎng)6h,加入血清后繼續(xù)培養(yǎng)12h.熒光顯微鏡下觀察發(fā)綠色熒光的BCs并計數(shù),轉(zhuǎn)染效率達(dá)30％.但隨后利用轉(zhuǎn)染BCs