異種造血嵌合體預防急性GVHD的作用機制.pdf

1、目的異種移植被認為是有潛力的解決器官供源不足的方法，但異種移植面臨的免疫排斥比同種異體移植更復雜，移植物抗宿主病(GVHD)更為嚴重。我們應用大鼠-小鼠造血嵌和體模型，進一步研究反向骨髓移植對aGVHD的預防機制。 方法1、異種骨髓嵌合體模型的建立：術前5天SD大鼠(8～10周齡，雌性，SPF級)開始飲含紅霉素(250mg/L)和慶大霉素(320mg/L)抗生素溶液凈化腸道。無菌條件下取BALB/C小鼠(8～10周齡，雌性，SP

2、F級)的骨髓細胞，制成單細胞懸液，SD大鼠接受7.5Gy(照射率0.5Gy/min)全身照射(TBI)后4小時內經尾靜脈輸入上述BALB/c小鼠骨髓細胞2×108/只，48小時后腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg(此預處理方案為非清髓性)，將該嵌合了BALB/c小鼠骨髓細胞的供體大鼠飼養(yǎng)30天后，檢測外周血嵌合率，并做皮片移植，結果證實小鼠源性骨髓已在大鼠體內植活，并誘導出對BALB/c小鼠的特異性耐受。再將該嵌合體SD大鼠的骨髓細胞移植到

3、目標受體(BALB/C小鼠)。 2、實驗分組：A，B，C組以BALB/C(8～10周齡，雌性，SPF級)小鼠為受鼠，D組以無關第3者B6小鼠為受鼠，腸道凈化后接受9Gy60Coγ射線致死性TBI：A組經尾靜脈輸注正常SD大鼠的骨髓細胞4×107/只；B組經尾靜脈輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細胞4×107/只；C組經尾靜脈輸注生理鹽水；D組經尾靜脈輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細胞4×107/只。觀察各組小鼠aGVHD的臨床表現(xiàn)及生存時間，

4、瀕死小鼠做病理分析。移植后15天測定TNF-α、INF-γ與IL-4的產量，移植后30天做混合淋巴細胞培養(yǎng)和皮片移植，并追蹤移植后小鼠嵌合率的變化。3、各組小鼠的GVHD評分及生存時間：評價GVHD包括5個參數：體重下降，弓背體態(tài)，活動度，皮毛質地，皮膚完整度。分析時每一項都有0-2個等級。評分為5項參數的分數總和，最高為10分。評分＞5分屬于重度GVHD，3-5分屬于中度GVHD，每周評分一次。每隔一定時間檢驗外周血WBC計數；并且比

5、較四組小鼠平均存活時間(MST)。 4、皮膚移植取SD大鼠及Whistar大鼠腹部全厚皮片，直徑約1cm，刮除皮下脂肪，分別移植于耐受誘導的BALB/C小鼠側背部移植床上，待干燥后用創(chuàng)可貼包扎傷口。于皮膚移植3天后剪開創(chuàng)可貼，開始每日觀察移植物的顏色、硬度，有無結痂、脫落及鼠毛生長。如皮片變硬或結痂脫落，則判定為移植物排斥；皮片柔軟或鼠毛生長則判定為存活或耐受。 5、細胞因子水平的測定移植后第5天用酶聯(lián)免疫吸附法(ELI

6、SA)測定A組與B組血清TNF-α，INF-γ與IL-4濃度。第14天取A組與B組的脾細胞，4×105個/孔鋪于96孔培養(yǎng)板中，加入用絲裂霉素滅活的異種抗原Whistar大鼠脾細胞2×105個/孔，于37℃、濕化的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后收集上清液，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測TNF-α產量，48小時后收集上清液，測INF-γ與IL-4量。 6、嵌合體的測定取移植后小鼠外周血50μl，加入FITC標記的抗大鼠MHC-CL

7、ASSⅠ單克隆抗體(1μg/106細胞)，避光，4℃下標記30分鐘。用紅細胞裂解液去掉紅細胞，PBS洗滌細胞2次，上流式細胞儀(FACScan；BectonDickinson)檢測移植小鼠外周血中大鼠源性細胞嵌合情況。 7、單向混合淋巴細胞反應(MLR)：檢測A、B組小鼠對特異供體及無關供者的反應性。分別取A、B組小鼠與正常BALB/C小鼠的脾細胞為反應細胞，以正常SD大鼠與Whistar大鼠脾細胞為刺激細胞，做混合淋巴細胞反應

8、(MLR)，于96孔培養(yǎng)板每孔加反應細胞100μl(4×105個)和刺激細胞50μl(2×105個)，設自體反應孔，每組3復孔，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96小時，終止培養(yǎng)前18小時，每孔加入1μCi3H-TdR(中國原子能研究所)，自動液閃計數器(Beckman，USA)測定，結果用cpm±SD表示。 結果：1、反向骨髓移植減輕GVHD：A組小鼠從移植后第4天開始出現(xiàn)弓背體位、體重下降、精神萎靡、活動度差、腹瀉、毛臟亂、皮

9、膚潰瘍等典型GVHD表現(xiàn)，第5天開始死亡并持續(xù)下去，至第60天累計存活率為50％(4/8)，GVHD發(fā)生率為100％，其中50％為重度(評分＞5分)。B組小鼠除第8天死亡1只外均存活至60天，第60天累計存活率為87.5％(7/8)，GVHD發(fā)生率50％，均為輕～中度(評分＜5分)。C組10天內均死于骨髓衰竭，證明此預處理方案是致死性的。與A組比較，B組GVHD的發(fā)生率及嚴重度降低，生存期明顯延長，而D組與A組比較無顯著性差異(P＞0.

10、05)，證明反向移植減輕GVHD的影響是供者特異性的. 2、反向骨髓移植可降低TNF-α與IFN-γ，升高IL-4：BMT后14天，B組脾細胞在異基因抗原刺激后產生的IL-4較A組高，同時IFN-γ與TNF-α產量顯著下降(P＜0.001)。BMT后第5天(GVHD死亡高峰期)測血清細胞因子濃度：B組血清IFN-γ，TNF-α水平明顯低于A組，而IL-4升高，與上述體外培養(yǎng)的結果相符。 3、混合淋巴細胞反應(MLR)結果

11、：移植第30天，A組與B組小鼠脾細胞對供體SD大鼠脾細胞的單向混合淋巴細胞反應特異性降低(與正常BALB/c小鼠比較，P＜0.001)，但對無關第3者Whistar大鼠的脾細胞有強烈的增殖反應，證明移植誘導的耐受是供者特異性的。其中，B組的增殖抑制程度更大，為(4641.97±174.97)cpm，同A組相比，二者有顯著性差異(P＜0.01)，提示反向移植可進一步抑制受鼠脾細胞對供者抗原的增殖。 4、病理分析：A組、D組死亡小鼠

12、病理學改變符合GVHD病理變化。表現(xiàn)為：①皮膚：基底細胞空泡變性、溶解壞死，大量淋巴細胞浸潤；②肝臟：，肝細胞呈不同程度的變性或壞死，匯管區(qū)有較廣泛淋巴細胞浸潤，③小腸：腸粘膜水腫和出血，，部分糜爛，小腸絨毛壞死脫落。黏膜下層淋巴細胞浸潤。病理改變屬于GVHDⅡ～Ⅲ級。B組小鼠病理改變明顯輕于A組D組，僅為輕度炎癥反應，為GVHDⅠ級。 5、移植皮膚存活情況：BMT后30d進行皮膚移植，B組移植小鼠對SD大鼠皮膚移植物的存活時間

13、明顯大于A組(P＜0.05)，但Wistar大鼠的皮膚移植物均在2周內排斥，與對照組(系天然BALB/C小鼠)比較無顯著性差異(P＞005)，表明嵌和體模型誘導出的組織移植耐受是供者特異性的。 6、嵌合率測定：移植后90天受者體內大鼠MHC-Ⅰ類分子陽性細胞比例仍為23.77±4.50％，明顯高于對照組，且對供體大鼠的MLR長期保持抑制狀態(tài)，供者皮膚移植物的存活時間明顯大于對照組，提示大鼠細胞能長時間以較高比例嵌合在小鼠體內，并

14、發(fā)揮正常功能.此外，我們研究了受者外周血WBC計數，B組造血恢復時間明顯縮短，從第9天起WBC計數始終比A組高，顯示反向BMT促進受者造血的重建。 結論：1、反向骨髓移植可降低GVHD發(fā)病率與嚴重度，延長移植小鼠的生存期，且影響是供者特異性的. 2、反向移植可通過減少Th1類細胞因子(如IFN-γ)產量，提高Th2類細胞因子(如IL-4)，極化供者T細胞向Th2方向極化，并進一步抑制受鼠脾細胞對供者抗原的增殖，從而減輕急