慢病毒轉(zhuǎn)染雞胚原始生殖細(xì)胞及性腺嵌合體雞的制備.pdf

1、原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells，PGCs)是精子或卵子的祖先細(xì)胞，是一種多能干細(xì)胞。由于原始生殖細(xì)胞可以直接將外源基因傳給后代，故以其作為轉(zhuǎn)基因載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞具有廣闊的前景。體外分離培養(yǎng)PGCs，并對(duì)其進(jìn)行遺傳操作，再將整合有外源基因的PGCs重新注入雞胚血管中，就可獲得性腺嵌合體，生產(chǎn)出穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因后代。 本實(shí)驗(yàn)從孵化5.5d的伊薩雞胚生殖嵴中分離原始生殖細(xì)胞，經(jīng)Ficoll密度梯度離心純化PG

2、Cs細(xì)胞，通過(guò)PAS(過(guò)碘酸希夫試劑)和AKP(堿性磷酸酶)染色鑒定，其純度可達(dá)70％。同時(shí)分離孵化5.5d的雞胚性腺基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，在添加多種生長(zhǎng)因子(白血病抑制因子mLIF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、白介素-11 IL-11、胰島素樣生長(zhǎng)因子hlGF-Ⅰ、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子hSCF)的條件下培養(yǎng)PGCs細(xì)胞，探索其體外培養(yǎng)的最佳條件。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pLenti6-eGFP慢病毒表達(dá)載體，與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞生產(chǎn)病

3、毒顆粒。將慢病毒濃縮后轉(zhuǎn)染雞胚PGCs，轉(zhuǎn)染率高達(dá)24.19％。通過(guò)顯微注射的方法，將轉(zhuǎn)染外源基因的PGCs供體細(xì)胞，濃縮后注入孵化2.5d的受體雞胚血液中，接受了供體PGCs細(xì)胞的受體雞胚繼續(xù)孵化至第8d。之后提取受體雞胚基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：在檢測(cè)的42只受體雞胚中，有2只發(fā)生性腺嵌合，嵌合率為4.8％。 本研究建立了分離PGCs、體外培養(yǎng)PGCs、制備嵌合體的方法，不僅可以提供豐富的供體細(xì)胞來(lái)源，還為轉(zhuǎn)基因