穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的胚胎干細(xì)胞及嵌合體小鼠的建立.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的胚胎干細(xì)胞及嵌合體小鼠的建立姓名：招霞申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：動物學(xué)指導(dǎo)教師：陳系古黃冰20040518中山大學(xué)碩十學(xué)位論文穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的胚胎干細(xì)胞及嵌合體小鼠的建立目的建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的胚胎干細(xì)胞亞系EsD3GFP細(xì)胞系；以GFP為報告蛋白研究ES細(xì)胞在胚胎中分化遷移的特性：建立綠色熒光蛋白嵌合體小鼠，為ES細(xì)胞途徑介導(dǎo)的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的制作構(gòu)建技術(shù)平臺：探討GFP作為報告蛋

2、白的有效性及安全性。方法1)穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的EsD3GFP細(xì)胞系的建立采用脂質(zhì)體Lipofectamine介導(dǎo)法將質(zhì)粒pEGFP—NI轉(zhuǎn)染Es—D3細(xì)胞，命名為ESD3GFP細(xì)胞。對其胚胎干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。2)ESD3一GFP細(xì)胞胚胎注射及綠色熒光蛋白嵌合體小鼠的產(chǎn)生對ES—D3GFP細(xì)胞進(jìn)行不同發(fā)育時期的胚胎注射。胚胎行體外單胚培養(yǎng)觀察，部分存活胚胎行假母子宮移植。3)綠色熒光蛋白嵌合體小鼠嵌合狀態(tài)的觀察和鑒定熒光鏡下觀察小鼠

3、大體和組織冰凍切片；提取基因組DNA，對GFP基因進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果1)穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的ES—D3GFP細(xì)胞系的建立EsD3GFP細(xì)胞具典型干細(xì)胞克隆形態(tài)，克隆發(fā)出較強(qiáng)綠色熒光，傳代后可持續(xù)表達(dá)。堿性磷酸酶染色、體外胚體形成實驗和裸鼠畸胎瘤成瘤實驗均為陽性。2)ESD3一GFP細(xì)胞胚胎注射及綠色熒光蛋白嵌合體小鼠的產(chǎn)生得到嵌合體小鼠4只，1只存活，3只死亡。胎盤和臍帶末見熒光。體外培養(yǎng)中均有胚胎顯示綠色熒光：熒光細(xì)胞傾向分布于內(nèi)