氯霉素單克隆抗體的制備以及膠體金快速診斷方法的初步建立.pdf

1、氯霉素(CAP)是一種廣譜抗生素，在食品中殘留后可對(duì)人體健康構(gòu)成潛在危害—引起人骨髓的造血機(jī)能紊亂，為此已被列為禁用藥。
　　 本研究以合成的免疫原BSA-CAP為基礎(chǔ)，通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備抗CAP單克隆抗體并建立氯霉素膠體金的快速檢測(cè)方法，為氯霉素在動(dòng)物性食品中的殘留檢測(cè)提供方法。包括如下三個(gè)部分。
　　 一、氯霉素完全抗原的制備與鑒定
　　 分別以牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)為蛋白質(zhì)載體，采用戊二

2、醛法、混合酸酐法和重氮法將半抗原CAP分別與BSA、OVA偶聯(lián)，合成了全抗原BSA-CAP和OVA-CAP。通過(guò)紫外掃描和SDS-PAGE電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)前載體蛋白BSA、OVA以及CAP標(biāo)準(zhǔn)品和反應(yīng)后形成的偶聯(lián)物的吸收峰發(fā)生改變，同時(shí)SDS-PAGE電泳的結(jié)果顯示偶聯(lián)物的分子量大于載體蛋白分子量，證明偶聯(lián)成功。由BCA法測(cè)定的全抗原濃度分別為:BSA-CAP(戊二醛法)2.6 mg/mL，BSA-CAP為（混合酸酐法）2.2 m

3、g/mL，OVA-CAP為1.4 mg/mL。根據(jù)紫外分光法和紫外吸收加和原理測(cè)得:BSA-CAP(戊二醛法)偶聯(lián)比1∶12;BSA-CAP（混合酸酐法）偶聯(lián)比1∶26; OVA-CAP偶聯(lián)比1:15。結(jié)果證實(shí)該抗原可以用于小鼠的免疫實(shí)驗(yàn)。
　　 二、氯霉素單克隆抗體的制備與鑒定
　　 用兩種不同的抗原BSA-CAP免疫BALB/C小鼠，三免之后ELISA檢測(cè)小鼠的血清效價(jià)以及對(duì)CAP的敏感性，最終選擇效價(jià)較高，對(duì)CAP

4、最敏感的9號(hào)小鼠進(jìn)行沖擊免疫。采用細(xì)胞融合技術(shù)，將沖擊免疫后小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞在PEG1450作用下融合，三次亞克隆篩選到產(chǎn)生抗CAP單克隆抗體的陽(yáng)性細(xì)胞株Ⅲ7E3和Ⅲ3A7。選取較好的Ⅲ7E3株誘生腹水，辛酸-飽和硫酸銨法純化單克隆抗體，純化后濃度為0.296 mg/mL，單抗對(duì)CAP敏感性的IC50為2.89 ng mL，效價(jià)為1∶12800。CAP單抗對(duì)青霉素、四環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素等交叉率均小于0.04％，可以用于膠

5、體金的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
　　 三、氯霉素膠體金免疫層析診斷方法的建立
　　 利用檸檬酸三鈉法制備膠體金，通過(guò)紫外掃描和電鏡掃描鑒定膠體金顆粒均一，粒徑大小為30 nm左右，以此作為標(biāo)記物標(biāo)記抗氯霉素單克隆抗體，其中1ml的膠體金最多可標(biāo)記30μL的單抗，并且應(yīng)加30μL的0.1mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法原理，將抗CAP的單抗的膠體金的標(biāo)記物稀釋2倍后噴涂于金標(biāo)墊上，人工合成的BSA-CAP抗原稀釋2