氣腫疽梭菌單克隆抗體的制備及膠體金診斷試紙條的研制.pdf

1、氣腫疽是一種急性、敗血性人獸共患傳染病，發(fā)病率和死亡率極高。當(dāng)前，對(duì)該病的診斷主要有病原學(xué)檢查、間接ELISA法和PCR檢測，但這些方法操作復(fù)雜，需用較多試劑及專門的儀器設(shè)備，不適合于現(xiàn)場的快速檢測。本研究旨在建立快速、準(zhǔn)確而簡便的檢測氣腫疽的膠體金免疫層析試紙條。
　　本試驗(yàn)制備氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）單克隆抗體，以全菌免疫BALB/c小鼠，融合后對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測篩選，再經(jīng)多次亞克隆最終獲得一株

2、能穩(wěn)定分泌氣腫疽梭菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1E4B6，經(jīng)鑒定，其亞型為IgG1，輕鏈為κ鏈；該單克隆抗體與腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌等無交叉反應(yīng)，可特異性識(shí)別氣腫疽梭菌。腹水效價(jià)為1:51200。對(duì)于該單克隆抗體的純化，采用Protein A親和層析經(jīng)硫酸銨法粗提單抗的方法。
　　免疫膠體金的制備為試驗(yàn)的重點(diǎn)。制備了20nm粒徑的膠體金顆粒，確定了膠體金與該單抗的最佳結(jié)合量為30μg/mL，最佳 pH值為8.4，最

3、佳 NC膜為Millipore HFB1350220型。將純化的氣腫疽梭菌多抗及羊抗鼠IgG分別以1:4和1：8的稀釋倍數(shù)噴于硝酸纖維素膜的T線和C線。對(duì)膠體金診斷試紙條進(jìn)行驗(yàn)證，敏感度高，可檢測到的最低抗原量為1*105CFU/mL；特異性強(qiáng)，無假陽性與交叉反應(yīng)現(xiàn)象；有較好的穩(wěn)定性。
　　氣腫疽膠體金免疫層析試紙條以免疫層析法為指導(dǎo)，根據(jù)抗原-抗體的特性，建立了此種不需要再加入任何檢測試劑的快速簡便的檢測方法，而且保質(zhì)期長可常溫