來(lái)自大黃魚(yú)腸道的弧菌拮抗菌的篩選、鑒定及其性能研究.pdf

1、大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)屬石首魚(yú)科黃魚(yú)屬，為我國(guó)主要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一。但是近年來(lái)，隨著大黃魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，各種魚(yú)病也頻繁發(fā)生，尤其是發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)、發(fā)病率和死亡率較高的弧菌病，給漁業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于傳統(tǒng)的抗生素等藥物長(zhǎng)期使用后會(huì)造成細(xì)菌的多重抗藥性、藥物殘留以及對(duì)環(huán)境產(chǎn)生危害，因此，人們開(kāi)始重視用生態(tài)方法防治魚(yú)病。益生菌是一種新興的生物防治方法，能夠改善養(yǎng)殖水體條件，促進(jìn)飼料消化吸收，增強(qiáng)宿主

2、疾病抵抗力等，具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，本研究旨在從健康大黃魚(yú)腸道內(nèi)分離篩選出對(duì)病原性弧菌具有拮抗作用的益生菌候選菌株，在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行分類學(xué)鑒定，并進(jìn)一步研究這些拮抗菌的益生價(jià)值，包括抗菌譜、胞外產(chǎn)物抑菌效果、氨氮降解、殘餌降解等方面，以期為功能益生菌的應(yīng)用、微生態(tài)制劑的研發(fā)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生態(tài)防病體系提供理論依據(jù)。
　　 本研究采用錳營(yíng)養(yǎng)瓊脂、硫檸膽蔗瓊脂(TCBS)、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、海水瓊脂(2216E)和淡水瓊

3、脂(FWA)培養(yǎng)基從大黃魚(yú)腸道中分離、篩選出對(duì)大黃魚(yú)病原弧菌副溶血弧菌(Vpl.2164)和溶藻弧菌(Va-Y)有較強(qiáng)拮抗作用的拮抗菌12株，編號(hào)分別為：X77,X93,X1402-1,X1109,X1108,X83,X3517,X3914,X1107,X1506,X96,X1401-1，占大黃魚(yú)腸道內(nèi)所分離細(xì)菌中的10.4％，其中錳營(yíng)養(yǎng)瓊脂選擇培養(yǎng)基上拮抗菌的比例最高，占50.0％，其次是EMB和FWA培養(yǎng)基，拮抗菌的比例均為16.7

4、％,最后是2216E和TCBS瓊脂，比例均為8.3％。通過(guò)點(diǎn)種法進(jìn)行的體外拮抗實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)兩株病原弧菌抑制作用最強(qiáng)的菌株是X1402-1、X1107、X93、X77和X1108，對(duì)Vpl.2164和Va-Y的抑菌圈分別為28.5mm和8.7mm、23.3mm和21.1mm、25.8mm和6.8nun、15.6rnm和9.0mm、12.0mm和9.0mm，而抗菌譜測(cè)定結(jié)果顯示，X77能夠?qū)?1株指示菌中的18株病原菌產(chǎn)生抑制，X1402-

5、1、X93、X1108、X1107分別能夠抑制16株、14株、13株和11株病原菌的生長(zhǎng)。因此，菌株X1402-1、X1107和X93對(duì)2株病原菌均有較強(qiáng)的拮抗作用，X77、X1402-1和X93的抗菌譜最廣。
　　 對(duì)12株細(xì)菌經(jīng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及16SrRNA基因序列分析鑒定，確定它們的分類地位。經(jīng)VITEK-32細(xì)菌快速鑒定系統(tǒng)鑒定，X77、X93和X3914分別與枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的相似性均為99.0％

6、：而X1402-1、X1107、X1109和X1506與銅綠假單胞菌的相似性分別為99.0％、98.0％、99.0％、99.0％：菌株X1108和X3517與惡臭假單胞菌的相似性均為99.0％，選取拮抗作用最強(qiáng)的拮抗菌X77、X93、X3914、X1402-1和X1108，通過(guò)16SrRNA基因序列分析表明，5株拮抗菌的16S rRNA基因序列分別與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(FJ947049)、短小芽孢桿菌Baci

7、llus pumilus(EU880532)、地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis(AB553280)、類產(chǎn)堿假單胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes(EU440977)和惡臭假單胞菌Pseudomonas putida(GU248219)的16SrRNA基因同源性最高，分別為99.0％、100.0％、99.0％、99.0％和100.0％。綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，5株拮抗菌分別被確定為：枯草芽孢桿

8、菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、類產(chǎn)堿假單胞菌和惡臭假單胞菌。
　　 根據(jù)溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照Sugita的方法制備3株芽孢桿菌(編號(hào)為：X77、X93、X3914)的胞外產(chǎn)物以及采用平板擴(kuò)散法研究了環(huán)境因子對(duì)其胞外產(chǎn)物抑制2株病原弧菌的抑菌活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拮抗菌的胞外產(chǎn)物的抑菌活性強(qiáng)弱以及同一菌株對(duì)不同病原菌的抑制能力強(qiáng)弱隨著培養(yǎng)時(shí)間的不同而不同，胞外產(chǎn)物對(duì)pH條件有一定的耐受性，對(duì)熱敏感，不耐高溫，過(guò)高的NaCl能使其抑

9、菌活性降低，蛋白酶K和不同濃度的FeCl3均對(duì)其抑菌活性產(chǎn)生影響。
　　 通過(guò)對(duì)菌株的降解能力進(jìn)行測(cè)試，采用靛酚藍(lán)分光光度法、比濁法、半微量凱氏定氮法、碘顯色法等分別對(duì)短小芽孢桿菌X93和地衣芽孢桿菌X3914的降解氨氮、殘余餌料的能力以及菌株生長(zhǎng)量進(jìn)行研究，測(cè)試其降解能力的強(qiáng)弱。結(jié)果表明，2株芽孢桿菌達(dá)到最大氨氮降解率的最適pH、溫度都是7.0和30℃，而在研究氨氮初始濃度對(duì)菌株降解氨氮能力的影響時(shí)，菌株X93和X3914達(dá)到

10、最大降解率時(shí)的氨氮濃度分別為50mg/L、100mg/L;菌株的接種量不同飼料的蛋白質(zhì)和淀粉的降解率也不同，且接種5％菌量的降解率均高于1％菌量的降解率，在48h,X93和X3914對(duì)飼料蛋白質(zhì)和淀粉的降解率分別為72.5％、72.8％和35.2％和52.6％，在48h以后降解率趨于穩(wěn)定，120h時(shí)的降解率分別為76.6％、80％和39.4％、60.5％。
　　 實(shí)驗(yàn)研究表明，在本文篩選的12株拮抗菌中，菌株X93和X3914的