戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株基因組全長cDNA的構(gòu)建及其改造.pdf

1、戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的急性病毒性疾病，該病屬于人畜共患病，對人類健康具有很大的危害。戊型肝炎病毒屬于肝炎病毒科（Hepeviridae Family）肝炎病毒屬（Hepevirus），為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約7.2kb，具有3個互相重疊的開放讀碼框架（Open reading frame，ORF），自病毒基因組的5'末端到3'末端依次排列著非

2、編碼區(qū)（UTR）、ORF1、ORF3和ORF2。3'端非編碼區(qū)是由腺嘌呤核苷酸組成的多聚腺苷酸尾（polyA），其中ORF3與ORF1、ORF2部分重疊，或完全包含在ORF2中。ORE1為非結(jié)構(gòu)區(qū)基因，主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2編碼病毒的衣殼蛋白；ORF3編碼功能未知的蛋白。
　　 目前戊型肝炎尚無有效的治療方法，唯一可行的是預(yù)防。因此，戊型肝炎疫苗的研制受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。對于戊肝的防治至今尚無商品化疫苗，多種基于DN

3、A重組技術(shù)的戊肝候選疫苗也處于研制階段。HEV感染性cDNA克隆以及細(xì)胞感染模型的建立對戊肝抗病毒研究和減毒活疫苗研究將有很大的幫助。
　　 基于以上分析，本研究利用分子生物學(xué)和反向遺傳學(xué)的技術(shù)和手段對本實驗室自行分離得到的3型戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株進(jìn)行基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建。實驗主要包括三個部分，首先用重疊延伸per（overlap pcr）的方法把實驗室已有的9個包含了HEV SAAS-JDY5株全部基因組信

4、息的片段連成4段；接下來結(jié)合In-fusion技術(shù)和以限制性內(nèi)切酶、連接酶為基礎(chǔ)的DNA重組技術(shù)把這4段連成基因組全長cDNA；最后為了保證全長cDNA克隆具有感染性，又用In-fusion技術(shù)對它進(jìn)行了改造。
　　 Overlap per的原理：設(shè)計具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。本實驗室已獲得SAAS-JDY5株HEV的全基因組序列和9個包

5、含了HEV全部基因組信息的片段，并且相鄰的片段之間都有一段重復(fù)序列，符合了overlap per的條件，所以首先想到的是用overlap pcr法連接這9個小片段。以相鄰的兩段為模板，第一段的上游引物和第二段的下游引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，就把兩個片段連接起來，得到新的長片段。重復(fù)上述操作直到把9個小片段連成4個2kb左右的長片段（1～2474，2094～4664，4340～6645，5186～7232）。此方法在操作過程中需注意兩個模

6、板的濃度和比例，最好保證摩爾比為1比1，而且濃度不能太低；另外退火溫度也需摸索，overlap pcr的退火過程中不僅僅有引物和模板的結(jié)合，還有兩段模板之間重復(fù)序列的結(jié)合，是整個過程的關(guān)鍵，因此需要反復(fù)摸索直到確定一個最佳退火溫度。由于是雙模板，比普通PCR難度要大，片段太長不容易擴(kuò)增出來，而且保真性也不好，所以只用這個方法連出大小為2kb左右的片段，后續(xù)的研究用傳統(tǒng)的內(nèi)切酶消化和連接酶處理以及In-fusion法。
　　 傳統(tǒng)

7、的以限制性內(nèi)切酶和連接酶為基礎(chǔ)的DNA重組技術(shù)曾經(jīng)革命性地推動了分子生物學(xué)和遺傳工程的發(fā)展，至今仍然發(fā)揮著重要作用。但是實驗室原有的片段太多，找酶切位點比較困難。用overlap pcr連成4個長片段后就相對容易一些，利用4626位置上的KpnⅠ和載體上的XbaⅠ這兩個酶切位點將中間兩段連接，從而形成3個大片段（1～2474，2094～6645，5186～7232）。In-fusion法的原理跟基因同源重組類似，利用DNA片段的同源關(guān)系

8、將目的片段定向地插入載體中。這個方法只需一個單一的酶切位點將載體線性化即可，不需要兩個單一的酶切位點，條件沒有前面苛刻，所以結(jié)合這個方法用于最后兩步連接。先利用載體上的XbaⅠ酶切位點將前兩段連接（1～5318），然后利用5245位置上的FseⅠ酶切位點將最后兩段連成HEV的全長cDNA。In-fusion法需要重新設(shè)計引物，使目的基因的兩端帶有載體兩端的同源序列。雖然也涉及到PCR過程，但是以質(zhì)粒為模板，難度相對overlap pcr

9、要小，可以擴(kuò)增3kb左右大小的片段用于連接。
　　 為了進(jìn)一步保證這個HEV的全長cDNA克隆具有感染性，又對它進(jìn)行了修正。在測序之后發(fā)現(xiàn)5’端有94個堿基與原序列比對不上，另外在2467的位置多出了5個堿基，我們需要將這一段替換掉。為了保證序列的準(zhǔn)確性，重新從病料中提取SAAS-JDY5株的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）。設(shè)計套式特異性引物，并在5’端引入T7 RNA聚合酶啟動子，進(jìn)行巢式PCR（Nest-PCR）擴(kuò)增出目