構(gòu)建人呼吸道合胞病毒反基因組cDNA及其拯救嘗試.pdf

1、目的：通過RNA反向遺傳學(xué)操作，克隆人呼吸道合胞病毒(human respiratorysyncytial virus，RSV)反基因組cDNA，并構(gòu)建以T7 RNA多聚酶(T7 RNApolymerase，T7 RNP)為啟動子、插入有綠色熒光蛋白(enhanced green fluorecentprotein，EGFP)的RSV反基因組cDNA重組質(zhì)粒pBRAT-RSV-EGFP，通過MVA-T7痘苗病毒等提供T7 RNP，探討拯

2、救可表達EGFP的重組人呼吸道合胞病毒(rRSVEGFP)的條件。
　　方法：利用分子病毒學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，以經(jīng)過改造的pBR322質(zhì)粒為克隆載體，通過多步克隆操作，獲得編碼RSV反基因組的cDNA克隆，并且將EGFP表達盒插入到RSV反基因組cDNA中，構(gòu)建重組RSV反基因組質(zhì)粒pBRAT-RSV-EGFP。克隆的反基因組cDNA位于T7啟動子下游和丁肝核酶（HDV ribozyme，δ）以及T7轉(zhuǎn)錄終止信號的上游，經(jīng)核酸內(nèi)切

3、酶及核酸序列分析后，分別用MVA-T7病毒、BSR T7/5細(xì)胞和pcDNA3.1-T7RNP質(zhì)粒提供T7 RNP，同時轉(zhuǎn)染pBRAT-RSV-EGFP，經(jīng)轉(zhuǎn)錄獲得重組RSV單股正鏈的反基因組，以可表達四種RSV核衣殼蛋白或多聚酶蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1-N-OPT、pcDNA3.1-P-OPT、pcDNA3.1-M2-1-OPT和pcDNA3.1-L-OPT為輔助質(zhì)粒，并共轉(zhuǎn)染至BSR T7/5細(xì)胞或瞬時表達T7 RNP的HEp-2

4、拯救rRSV/EGFP，觀察綠色熒光表達情況評估拯救的條件。
　　結(jié)果：經(jīng)核酸內(nèi)切酶及核酸序列分析證實，RSV反基因組cDNA及插入有EGFP的RSV反基因組cDNA克隆及其重組質(zhì)粒均成功獲得。與BSR T7/5細(xì)胞和pcDNA3.1-T7RNP質(zhì)粒相比，以MVA-T7感染HEp-2細(xì)胞，能夠高效提供T7 RNP，是用于重組RSV拯救的有效方法。
　　結(jié)論：成功克隆及構(gòu)建了可表達EGFP的RSV反基因組cDNA及其重組質(zhì)粒，