大豆基因組SSR分布特征和高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、整合與應(yīng)用.pdf

1、大豆[Glycine max(L.) Merr.]起源于中國，由一年生野生種（G.soja Sieb.&Zucc.）馴化而來，在我國已經(jīng)有大約5000年的種植史。目前，我國大豆種質(zhì)庫中已經(jīng)收集了23，587份種質(zhì)資源材料，為大豆育種提供了寶貴的基因資源。大豆以其含有優(yōu)質(zhì)蛋白和高脂肪含量的特性，日益成為世界上最重要的豆科作物之一。近年來，大豆育種的目標(biāo)不僅在于不斷提高大豆的產(chǎn)量而且更加注重品質(zhì)的改良。隨著大豆基因組學(xué)研究的飛速發(fā)展，分子育

2、種必將成為大豆遺傳改良的重要途徑。構(gòu)建高密度的、穩(wěn)定的遺傳圖譜將為質(zhì)量/數(shù)量性狀的遺傳研究、標(biāo)記輔助選擇(MAS)、基因圖位克隆、比較基因組學(xué)研究、物理圖譜構(gòu)建乃至全基因組的序列組裝提供基本的工具。特別是構(gòu)建基于我國種質(zhì)材料的、高密度的大豆遺傳圖譜將更有效地服務(wù)于我國的大豆分子育種實(shí)踐。
　　 本研究的主要內(nèi)容是:利用現(xiàn)有的序列信息，分析大豆基因組內(nèi)SSR的分布特征和開發(fā)新的SSR標(biāo)記并用于構(gòu)建高密度的大豆遺傳連鎖圖譜;在此基礎(chǔ)

3、上通過整合7個(gè)不同群體（NJRIKY、NJRSXG、NJRSBN、NJBIEX、NJSPNN、NJTFSX、NJRSWT）的數(shù)據(jù)構(gòu)建一張高密度的基于SSR標(biāo)記的整合圖譜，并對大豆基因組的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，主要結(jié)果如下:
　　 1.大豆基因組SSR分布特征分析
　　 對439，714條大豆EST進(jìn)行聚類，得到包含95，637個(gè)unigene的EST-unigene數(shù)據(jù)庫。其中包括62，620個(gè)contig和33，017個(gè)s

4、ingleton。在重復(fù)基元的總長度為14bp以上的條件下，對大豆的95，637個(gè)unigene和40個(gè)BAC克隆序列進(jìn)行SSR分析。其中，在9，844(10.29％)個(gè)unigene序列中包含有11，681個(gè)SSR重復(fù)基元(motif)，包括106個(gè)復(fù)合型SSR，其中三核苷酸重復(fù)基元最多(46.57％)，二核苷酸重復(fù)基元次之(37.56％)。在40個(gè)BAC序列中包含有772個(gè)SSR重復(fù)基元，其中包括8個(gè)復(fù)合型SSR，二核苷酸重復(fù)基元最

5、多(60.47％)，三核苷酸重復(fù)基元次之(25.26％)。四到六核苷酸的重復(fù)基元在unigene和BAC序列中的發(fā)生頻率都小于10％，且無明顯差異。由此推論在unigene序列中，SSR的頻率為SSR/6.75 kb;在BAC基因組序列中SSR的頻率為SSR/7.19 kb。
　　 在SSR重復(fù)基元中，不同堿基序列出現(xiàn)的頻率也不相同，主要分為17種不同的類型。在unigene序列中，最常見的重復(fù)基元序列是AG/TC(22.86％

6、)，其次為AT/TA(11.77％)和AAG/TTC(11.06％);在BAC克隆序列中最常見的重復(fù)基元序列均為AT/TA(41.49％)，其次為AAT/TTA(13.22％)和AG/TC(11.52％)。在四和五核苷酸重復(fù)基元中，AAAN/TTTN和AAAAN/TTTTN，特別是（AAAT）n和（AAAAT）n的發(fā)生頻率最高。在此基礎(chǔ)上，開發(fā)了540對EST-SSR和231對BAC-SSR引物，同時(shí)用于NJRSXG和NJRIKY圖譜的

7、構(gòu)建。BAC-SSR引物在NJRIKY和NJRSXG群體間的多態(tài)性分別為36.80％和31.17％，明顯高于EST-SSR引物的多態(tài)性19.40％和13.70％。合并兩個(gè)群體的數(shù)據(jù)后，來源于BAC序列的引物多態(tài)性可以達(dá)到45.45％，來源于unigene序列的引物多態(tài)性達(dá)到了28.33％。
　　 分別隨機(jī)選取定位在整合圖譜中的35對EST-SSR和35對BAC-SSR引物，利用本實(shí)驗(yàn)室常用的6個(gè)作圖群體的12份親本材料，對新開發(fā)

8、的SSR引物進(jìn)行遺傳評價(jià)。70對引物共檢測到332個(gè)等位基因，其中176個(gè)等位基因來自代表非編碼區(qū)序列的BAC克隆，156個(gè)等位基因來自代表編碼區(qū)的unigene。每個(gè)位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)在2-8個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測到4.7個(gè)等位基因。其中檢測到5個(gè)等位基因的位點(diǎn)數(shù)最多(31.43％)。GNB128檢測到的等位基因數(shù)最多（8個(gè)），而且來自于BAC序列的引物比來自于unigene序列的引物可以檢測到更多的等位基因數(shù)(5.02 vs4.4

9、6)。70對引物中超過90％的引物的PIC值都大于0.5，并且有14個(gè)引物的PIC值超過了0.75。
　　 2.大豆重組自交系群體NJRSXG的結(jié)構(gòu)分析及SSR圖譜構(gòu)建和應(yīng)用
　　 利用447對覆蓋大豆全基因組的SSR引物，對RIL群體NJRSXG的147個(gè)家系進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。結(jié)果表明，絕大多數(shù)SSR座位趨于純合，所有家系基本純合，母本先進(jìn)1號及父本趕泰2-2對群體的遺傳貢獻(xiàn)分別為0.485和0.515，群體各家

10、系基因型組成符合正態(tài)分布。利用該群體構(gòu)建了一張包含400個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳圖譜，包括23個(gè)連鎖群，圖譜總的遺傳距離為1，447.9 cM，標(biāo)記平均密度為3.9 cM/標(biāo)記。
　　 利用NJRSXG圖譜采用采用QTLNetWork2.0軟件對2005和2006年的大豆種子蛋白質(zhì)含量進(jìn)行QTL定位，共檢測到5個(gè)控制種子蛋白含量的加性效應(yīng)QTL，分別位于A2-2、B2、D1a-2和K連鎖群上，其中1個(gè)表現(xiàn)為遺傳正效應(yīng)，4個(gè)表現(xiàn)為遺傳負(fù)

11、效應(yīng)，總的遺傳貢獻(xiàn)率為42.88％。另外檢測到3對影響種子蛋白質(zhì)含量的加性(×)加性上位互作效應(yīng)的QTL，分布在F、G、K、H、L和O連鎖群上，遺傳貢獻(xiàn)率為7.14％。另外還檢測到3個(gè)QTL與環(huán)境存在互作，遺傳貢獻(xiàn)率為0.71％。而且3對上位效應(yīng)都檢測到了與環(huán)境的互作，遺傳貢獻(xiàn)率為1.22％。其中，與qPTK-1（Satt459-GNB173）連鎖的標(biāo)記GNB173被定位在了BAC克隆AC173960(133kb)上。
　　 3

12、.大豆重組自交系群體NJTIKY圖譜的加密及應(yīng)用
　　 在前人研究的基礎(chǔ)上，利用新開發(fā)的540對EST-SSR和231對BAC-SSR引物和部分其它引物對NJRIKY遺傳圖譜進(jìn)行了加密。更新后的圖譜共有834個(gè)位點(diǎn)，包括580個(gè)SSR位點(diǎn)、184個(gè)RFLP位點(diǎn)、44個(gè)EST位點(diǎn)，15個(gè)RAPD位點(diǎn)，7個(gè)TFs3(')末端位點(diǎn)、3個(gè)經(jīng)典標(biāo)記位點(diǎn)和一個(gè)未知標(biāo)記位點(diǎn)。其中新開發(fā)的引物產(chǎn)生的SSR位點(diǎn)為199個(gè)，分布在24個(gè)連鎖群上。更

13、新后的圖譜覆蓋大豆基因組2307.8 cM，標(biāo)記間的平均密度為2.8 cM，圖譜總長度減小了1288.1 cM。各連鎖群上大于20 cM的gap數(shù)目由原來的42個(gè)減少到0個(gè)。
　　 利用更新后的NJRIKY圖譜將8個(gè)SMV抗性基因定位在了D1b連鎖群上，增加了抗性基因間的標(biāo)記數(shù)目，進(jìn)一步驗(yàn)證了抗性基因成簇分布的現(xiàn)象。其中，與Rsc20連鎖的2個(gè)標(biāo)記GNB026(69.5 cM)和GNB053(72.1 cM)被定位在了大豆基因組

14、序列的Supercontig_74上。利用CIM法，同時(shí)檢測到了與10個(gè)性狀相關(guān)的113個(gè)QTL，分布在12個(gè)不同的連鎖群上。與圖譜更新前相比，部分QTL的位置發(fā)生了改變，絕大多數(shù)QTL的置信區(qū)間明顯縮短，與相鄰標(biāo)記的連鎖更加緊密。同時(shí)在H、N和O連鎖群上分別檢測到了10、6和27個(gè)新的QTL位點(diǎn)。所有檢測到的QTL中遺傳貢獻(xiàn)率超過10％的QTL有55個(gè)。
　　 4.大豆整合圖譜的構(gòu)建及基因組結(jié)構(gòu)分析
　　 使用Join

15、Map3.0軟件，以NJRIKY圖譜為基礎(chǔ)，整合來自7個(gè)群體的2，623個(gè)分離數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一張包含1，378個(gè)位點(diǎn)的整合圖譜，其中包括1，124個(gè)SSR位點(diǎn)，占位點(diǎn)總數(shù)的81.6％。該圖譜包含20個(gè)連鎖群，覆蓋了基因組2，444.2 cM的遺傳距離，每個(gè)連鎖群的標(biāo)記密度為0.74（F連鎖群）到3.59（I連鎖群），平均密度為1.77 cM。每個(gè)連鎖群上的標(biāo)記數(shù)在33到154之間，平均每個(gè)連鎖群有69個(gè)標(biāo)記。每個(gè)連鎖群的長度變化在83.8

16、3 cM（B2連鎖群）到188.18 cM（A2連鎖群）之間，平均長度為122.21 cM。每個(gè)連鎖群上的SSR標(biāo)記數(shù)為23個(gè)（D1a連鎖群）到139個(gè)（F連鎖群），平均為56.2個(gè)。仍有15個(gè)大于10 cM的gap，其中包括位于H連鎖群(26.92 cM)和I連鎖群(24.09 eM)上的2個(gè)大于20 cM的gap。
　　 375個(gè)定位在整合圖譜中的unigene中，具有功能的有252個(gè)。其中159個(gè)unigene被成功的進(jìn)行

17、了GO分類，包括生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)類型。其中，101個(gè)unigene(63.52％)參與生物進(jìn)程，90個(gè)unigene(56.6％)參與細(xì)胞組分，分子功能中包含114個(gè)unigene(71.7％)。生物進(jìn)程中所占比例最大的是metabolic processes(60.4％)，其次是cellular process(57.41％);細(xì)胞組分中所占比例最大的是cells(98.9％)，其次是cell part(93.3％);

18、分子功能中所占比例最大的是catalysis(68.4％)，其次是binding(54.4％)。為大豆的功能基因定位、圖位克隆和分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。
　　 利用36個(gè)BAC克隆的141個(gè)BAC-SSRs位點(diǎn)，將15個(gè)大豆基因組的Supercontig序列定位在了整合圖譜中1-13個(gè)不同的連鎖群上，并在此基礎(chǔ)上鑒定出基因組內(nèi)廣泛存在的部分同源區(qū)段，為大豆起源于古多倍體提供了新的遺傳學(xué)證據(jù)。同時(shí)結(jié)合BAC克隆與unigene

19、的精確匹配，估計(jì)大豆基因組內(nèi)基因的數(shù)目為52，278個(gè)。
　　 利用來自7個(gè)群體的2，623個(gè)分離數(shù)據(jù)對大豆基因組的偏分離特點(diǎn)進(jìn)行分析，并將376個(gè)偏分離位點(diǎn)定位在了不同群體的遺傳圖譜中。每個(gè)群體中偏分離的百分率分布并不相同，最小的為NJRSWT(6.7％)，最大的為NJTFSX(25.6％)。定位到圖譜中的偏分離位點(diǎn)有的表現(xiàn)為成簇分布，有的則表現(xiàn)為隨機(jī)分布。其中A2、C2、D1b、F、N和K連鎖群在不同的群體中都發(fā)現(xiàn)了偏分離位