豬細(xì)小病毒的分離鑒定及NS1基因、VP2基因的克隆測序分析.pdf

1、豬細(xì)小病毒（Porcince parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一，感染妊娠前期的母豬后主要引起母豬流產(chǎn)、胚胎死亡、胎兒畸形、木乃伊化、弱胎及不孕等危害，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。本研究對泰安地區(qū)的散養(yǎng)豬場隨機進行血清學(xué)調(diào)查，調(diào)查PPV的感染和流行情況；對采集的臨床豬病料進行分離鑒定，以確定發(fā)病原因，了解PPV的病原學(xué)特征；對分離得到的PPV進行克隆測序分析，分析病毒的分子生物學(xué)特征，為我國PPV的研究積累寶貴

2、的資料。
　　 本研究對泰安地區(qū)的散養(yǎng)豬場進行血清學(xué)調(diào)查，通過乳膠凝集試驗，發(fā)現(xiàn)在該地區(qū)的豬場中，100份血清樣品有34份是陽性，PPV的血清陽性率達34％，而經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬的血清學(xué)陽性的樣品分別有18份和9份，陽性率分別是36％和30％，種公豬血清學(xué)陽性樣品有7份，陽性率為35％，結(jié)果表明該地區(qū)豬場PPV感染率較高。
　　 對從臨床流產(chǎn)胎兒病例中采取的20份病料（心、肝、腎、肺、腦）利用PK-15細(xì)胞對PPV進行分

3、離鑒定，在PK-15細(xì)胞上產(chǎn)生病變的病料有4份，將這4份病料進行包括理化性質(zhì)鑒定、紅細(xì)胞血凝譜實驗和特異性試驗在內(nèi)的常規(guī)病毒學(xué)鑒定和PCR鑒定。分離出的病毒耐脂溶劑，耐酸，耐熱，對胰酶不敏感；能很好的凝集豚鼠、貓、大鼠、小鼠和雞的紅細(xì)胞，不能凝集牛和豬的紅細(xì)胞，8單位的抗PPV抗體可以使待檢病毒的HA效價降低8倍以上，說明對所分離的病毒HA有特異性的抑制作用。PCR擴增出1740bp的目的片段，以上結(jié)果都表明分離出的病毒是PPV，PCR

4、擴增更是證明分離出的病毒是同一株。
　　 把從病料中分離出來的PPV命名為PPV泰安株（PPV-TA），根據(jù)GeneBank上已公布的PPV序列分別設(shè)計合成了PPV的腳基因和VP2基因的特異性引物，對PPV-TA進行PCR擴增，得到2個PCR產(chǎn)物，分別將這兩個PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，進行克隆測序分析。通過分析得知PPV-TANS1基因長1989bp，編碼662個氨基酸，與參考PPV NS1基因核苷酸同源性在98.3％～

5、99.9％之間。糖基化位點是356NLS、446NFS、513NLT，磷酸化位點是Thr435和Ser473，與參考毒株相同。PPV-TA VP2基因長1740bp，編碼579個氨基酸，與PPV參考毒株VP2基因核苷酸同源性在98.3％～99.8％之間，決定PPV的組織嗜性的位點位于378、383、436位，與PPV NADL-2株和PPV china株相同。VP2蛋白有9個線性抗原為點，分別是21-GNESGGGGGGGGG-33，1

6、68-DLTASLMVALDTNNT-182，239-HSDIMFYTIENAVPIHLLRTGD-260，310-ANTRKGYHQTINNSYT-325，326-EATAIRPAQVGYNTPYM-342，367-DEPNGAIRFTMDYQHGH-383，376-TMDYQHGHLTTSS-388，385-TTSSQELERYTFNPQ-399，437-NMHFMNTLNTYGPLTAL-453，與PPV NADL-2株和PPV