豬細(xì)小病毒S-1株VP2和NS1基因的原核表達(dá)及其間接ELISA的初步建立.pdf

1、本試驗(yàn)利用PCR技術(shù)從豬細(xì)小病毒S-1株中成功擴(kuò)增了VP2和NS1基因的片段，然后將PCR產(chǎn)物分別克隆至載體pET32c，構(gòu)建了的重組質(zhì)粒pET32c-VP2和pET32c-NS1原核表達(dá)載體。經(jīng)雙酶切和測(cè)序分析鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確可靠。 含有豬細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21中，IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。確定IPTG終濃度為0.3-0.6mmol/L，37℃培養(yǎng)6h時(shí)表達(dá)量最佳。SDS-P

2、AGE電泳結(jié)果顯示，重組VP2蛋白獲得高效表達(dá)，且以包涵體形式存在。Western-Blot顯示有良好的免疫原性。變性、復(fù)性后回收率較低為30％。Ni2+樹(shù)脂進(jìn)行層析純化，純化后的蛋白濃度為0.63mg/ml，純度達(dá)75％。 確定NS1優(yōu)化表達(dá)的條件為IPTG終濃度為0.3-0.6mmol/L，20℃培養(yǎng)16h時(shí)表達(dá)效果好，且減少了包涵體的形成。Western-Blot顯示有良好的生物活性。純化后計(jì)算得濃度為0.50mg/ml。

3、 純化后的重組蛋白作為抗原，分別包被酶標(biāo)板，通過(guò)優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，最終確定VP2、NS1包被濃度分別為3.1μg/ml、2.5μg/ml，血清稀釋1:100、酶標(biāo)二抗稀釋度1:8000、血清和酶標(biāo)二抗溫育1h時(shí)效果最好。優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件，建立的間接VP2-ELISA和NS1-ELISA分別檢測(cè)6份陰性血清，將結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理，確定陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為OD待檢血清≥0.5且OD持檢血清/OD標(biāo)準(zhǔn)陰性值≥2.1。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的間接V