豬腦心肌炎病毒VP1蛋白的表達(dá)與單克隆抗體的研制.pdf

1、腦心肌炎（Encephalomyocarditis）是一類重要的急性人畜共患性傳染病，以腦炎、心肌炎或心肌周圍炎為臨床主要特征，其病原即腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus，EMCV）可感染的宿主種類很廣，包括豬、嚙齒類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和某些昆蟲(chóng)，其中豬被認(rèn)為是最易感的宿主。腦心肌炎病毒的感染可使斷奶仔豬發(fā)生急性心肌炎和突然死亡，使懷孕母豬發(fā)生嚴(yán)重的繁殖障礙。腦心肌炎病毒在分類上屬于小核糖核酸病毒科心臟病毒屬

2、的成員，是單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約7.8kb，有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框。病毒粒子無(wú)囊膜，由VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白組成。這四種結(jié)構(gòu)蛋白上都有抗原表位，其中以VP1的抗原性最強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。本研究利用PCR方法擴(kuò)增VP1基因并在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)了重組蛋白VP1；以純化的VP1蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，獲得7株抗VP1的單克隆抗體，具體內(nèi)容包括：
　　 1.EMCVVP1基因的原核表

3、達(dá)與抗體制備
　　 以重組質(zhì)粒pET32a-VP1為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到含完整閱讀框的VP1基因。獲得的目的基因克隆至原核表達(dá)載體pET28a中，經(jīng)酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)入E.coliBL21中，加IPTG誘導(dǎo)獲得重組蛋白pET28a-VP1，大小為33kDa。Westernblot結(jié)果顯示，該重組蛋白可與抗EMCV的多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。經(jīng)ProBondTMPurificationSystem純化的pET28a-VP1蛋白用來(lái)

4、免疫BALB/c小鼠，獲得了抗VP1蛋白的多克隆抗體。Westernblot和IFA結(jié)果表明，該多抗可特異性地結(jié)合VP1蛋白和EMCV。
　　 2.EMCVVP1單克隆抗體的制備
　　 取純化的pET28a-VP1蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)、間接ELISA方法對(duì)陽(yáng)性克隆的篩選以及多次亞克隆后，獲得7株能穩(wěn)定分泌抗VP1蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1F3、1G8、2C8、3A9、6E11、7A7和7C9

5、，Westernblot和IFA表明，這7株單抗能特異性識(shí)別VP1蛋白和EMCV。ELISA方法測(cè)定，雜交瘤細(xì)胞株上清效價(jià)分別為：1:12800，1:102400，1:51200，1:51200，1:102400，1：102400和1:102400；腹水效價(jià)分別為：3.072×106，1.536×106，3.072×106，6.144×106，6.144×106，6.144×106，3.072×106。經(jīng)小鼠單克隆抗體Ig類/亞類鑒定試