禽腦脊髓炎病毒VP1基因的克隆、表達及其單克隆抗體的制備.pdf

1、禽腦脊髓炎(AE)是一種由禽腦脊髓炎病毒(AEV)引起的以侵害幼禽中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主要特征的接觸性傳染病，以病禽共濟失調(diào)、震顫和非化膿性腦脊髓炎為主要特征，雞、火雞、野雞、鵪鶉均可感染。1930年首先在美國發(fā)現(xiàn)該病，現(xiàn)已遍及世界大多數(shù)國家。我國自1980年以來，先后在廣東、江蘇、遼寧、黑龍江、河北、內(nèi)蒙古、福建、上海等省市區(qū)發(fā)生，對養(yǎng)禽業(yè)造成很大危害。 禽腦脊髓炎病毒(AEV)的培養(yǎng)較為困難，從而影響了對該病的深入研究。目前一般都

2、采用免疫學方法，如免疫熒光(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來直接檢測抗原，但費時費力；國外也有用AEV單克隆抗體建立的免疫組化、間接免疫熒光和免疫過氧化物酶染色等方法檢測AEV抗原的成功報道。 本研究的目的是運用基因工程技術(shù)克隆出AEV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因，并以重組蛋白為抗原制備特異性抗體，為快速大量制備AE的檢測抗原提供了條件，也為建立快速診斷和檢測AEV的特異性方法奠定了基礎(chǔ)。為此，主要有如下工作： 1.AEV

3、結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的克隆和原核表達以初步純化的AEVVR株提取的RNA為模板，根據(jù)已發(fā)表的AEV1143株結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因序列，設計一對特異性引物，分別在上游引物引入EcoRI酶切位點，下游引物引入XhoI酶切位點。經(jīng)RT-PCR方法擴增出AEV結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1，克隆入pGEM-Teasy載體并經(jīng)測序分析，VP1基因全長約為810bp，與已發(fā)表的AEVVR株VP1序列完全一致，與1143株VP1基因序列同源性為94.7％。純化后用E

4、coRI和XhoI雙酶切，將VP1基因定向克隆入pGEX-6P-1載體谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶基因的下游，并把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導后，VP1基因得以表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，確定表達的融合蛋白大小約為58kD。 2.禽腦脊髓炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的單克隆抗體的制備及初步鑒定 以重組蛋白(pGEX-VP1)表達并純化的融合蛋白GST-VP1作為抗原，免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，末次加強免

5、疫后3d取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，由HAT選擇培養(yǎng)，通過間接ELISA反復篩選陽性克隆，經(jīng)有限稀釋法進行3次以上的亞克隆，得到兩株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株：H7和E3，并制備了腹水，腹水效價分別為16log2，14log2；Western-blot結(jié)果顯示該單抗有較強的特異性，且不與GST反應；利用該單抗初步建立了間接ELISA、特異性試驗等檢測AEV抗原的方法，為進一步建立特異性強、敏感性高、簡便快速的AEV