犬瘟熱病毒的分離及單克隆抗體的研制.pdf

1、犬瘟熱(CD)是一種由犬瘟熱病毒(CDV)引起的犬急性傳染病。CDV屬于副粘病毒科的麻疹病毒屬。主要引起犬科、鼬科和浣熊科動物犬瘟熱的發(fā)生，大熊貓和小熊貓等我國珍稀野生動物也不能幸免。但是伴隨生態(tài)環(huán)境的變化和CDV對動物流行病因素的適應，它的自然感染宿主范圍在不斷擴大。 一、表達犬CD150的Vero細胞系的建立及犬瘟熱病毒的分離犬瘟熱病毒的分離和培養(yǎng)是確診犬瘟熱的最根本方法，選擇適合的細胞是分離和培養(yǎng)的關鍵。目前，在用Vero

2、細胞系進行CDV分離和培養(yǎng)時，需要傳代數次或添加胰酶，才有可能產生細胞病變，而有些CDV毒株經處理后仍不能產生細胞病變，這樣就給CDV的研究帶來不便。有報道稱，淋巴細胞活化信號分子(SLAM，CDl50)是CDV等病毒的受體。本研究通過PCR技術擴增犬白細胞中的CDl50基因，構建真核表達載體plRES-CDl50，轉染Vero細胞，利用G418進行篩選，挑取單個細胞克隆進行培養(yǎng)，建立了Vero-CDl50細胞系。通過PCR技術和流式細

3、胞術對Vero-CDl50細胞系進行鑒定，同時檢測該細胞系的遺傳穩(wěn)定性和培養(yǎng)特性，發(fā)現該細胞系培養(yǎng)方法與Vero細胞相似，且多次傳代復蘇后，仍能穩(wěn)定表達CDl50基因。利用Vero-CDl50細胞系分離CDV，出現明顯的細胞病變，且通過RT-PCR技術擴增出病毒的特異性片段，將分離到的一株CDV命名為CDV0701株。 二、犬瘟熱病毒H、F基因的原核表達及單克隆抗體的制備利用PCR技術，擴增出CDV0701株血凝素蛋白(H)基因

4、以及融合蛋白(F)基因，將H基因和F基因分別插入原核表達載體pGEX-6P-1中谷胱甘肽S．轉移酶(GST)基因的下游，獲得重組質粒pGEX-H和pGEX-F。通過對重組大腸桿菌的菌體裂解物的SDS．PAGE電泳分析表明，重組菌能正確表達GST-H和GST-F融合蛋白。分別以純化的融合蛋白GST-H和GST-F免疫BAIJB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞與SP2/0胃髓瘤細胞融合，經間接酶聯免疫吸附試驗(ELJSA)篩選分泌單克隆抗體的雜交

5、瘤細胞。獲得2株針對CDV H蛋白的單抗雜交瘤細胞株，分別命名為4A10和2D5，其腹水型效價分別為2.56×104、2.56×104；獲得3株針對CDV F蛋白的單抗雜交瘤細胞株，分別命名為3E10、5F9和1G2，其腹水型效價分別為1.28×104、1.28×104、2.56×104。ELISA和Western-blot分析結果顯示，以上5株單抗僅與對應的蛋白質反應，而與原核表達載體pGEX-6P-1蛋白不反應。間接免疫熒光試驗顯示