豬腦心肌炎病毒（EMCV）重組VP1表位蛋白間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一種重要的人畜共患病病原，會(huì)引起豬和某些哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物乃至靈長(zhǎng)類動(dòng)物的一種以腦炎、心肌炎或心肌周圍炎為主要特征的急性傳染病。EMCV可感染多種哺乳動(dòng)物、鳥類、昆蟲和人類，對(duì)多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物宿主有高度傳染性。嚙齒動(dòng)物感染EMCV，沒有明顯的病理變化。自然條件下，EMCV感染最廣泛和最嚴(yán)重的動(dòng)物是豬，感染后可造成突然死亡和實(shí)質(zhì)器官的廣泛病理?yè)p傷，母豬感染還可造成

2、繁殖障礙。EMCV在分類上屬小RNA病毒科，心肌病毒屬，是一種無(wú)囊膜的單股正鏈RNA病毒。病毒粒子直徑27nm，20面體對(duì)稱，外表光滑呈球形。蛋白衣殼由60個(gè)衣殼粒子組成，每個(gè)衣殼粒子含有4種結(jié)構(gòu)蛋白，即VP1、VP2、VP3和VP4。其中VPl的抗原性最強(qiáng)，且與病毒粒子表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、抗原性、受體吸附以及脫殼有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在分析腦心肌炎病毒VPl蛋白抗原表位的基礎(chǔ)上人工合成一段含VPl抗原表位的雙鏈DNA序列(150bp)，克隆于原核表

3、達(dá)載體pGEX-6p-1，經(jīng)酶切鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21感受態(tài)細(xì)胞，以異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。經(jīng)GSTrap FF親和層析柱過柱獲得純化蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示相對(duì)分子質(zhì)量為30800。Western-blot分析結(jié)果表明，該重組蛋白具有較強(qiáng)的反應(yīng)原性。測(cè)定其濃度后，于-20℃保存。為了探討該蛋白的免疫原性，將該純化蛋白免疫小鼠，獲得的血清效價(jià)大于為1:12800，經(jīng)GST蛋白

4、孵育后效價(jià)為1:800。Western-b1ot結(jié)果顯示該融合蛋白與經(jīng)過空載體pGEX-6p-1表達(dá)的GST蛋白孵育的抗血清反應(yīng)后有明顯的特異性條帶。這表明所獲得的純化后的蛋白具有良好的抗原性。 利用該重組抗原，建立了檢測(cè)豬腦心肌炎病毒血清抗體的間接ELISA診斷方法。經(jīng)研究確定：0.05mol／1，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被液；抗原最適包被濃度為2μg／mL，血清最適稀釋度為1:50，其作用時(shí)間為90min，酶標(biāo)抗體最適稀釋