Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1蛋白單克隆抗體的純化及抗原表位的鑒定.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus)引起的以侵害雛鴨為主的高死亡率的烈性傳染病。該病毒可分為3個血清型，即DHV-Ⅰ、DHV-Ⅱ和DHV-Ⅲ。這3個血清型之間無血清學(xué)交叉反應(yīng)，三個血清型中DHV-Ⅰ分布最為廣泛，分為A、B和C3個基因型，主要發(fā)生于3周齡以下雛鴨的傳播迅速、致死率高。Ⅱ型和Ⅲ型DHV只在英國和美國有過相關(guān)報道，但致死率較低。我國感染的鴨

2、肝炎主要是由DHV-Ⅰ引起，1周齡的雛鴨感染最為嚴(yán)重，感染后的后死亡率幾乎高達(dá)為100％，目前已成為危害中國養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一。DHV-Ⅰ在世界范圍內(nèi)流行和分布，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要病原，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本研究對2株凍存的抗DHV-Ⅰ VP1蛋白的陽性雜交瘤細(xì)胞2D9、2D10分別進(jìn)行了復(fù)蘇，并分別進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng)，最后將擴(kuò)大培養(yǎng)的陽性雜交瘤細(xì)胞腹腔注入6周齡的Ba(l)b/c小鼠，大約每只注射2×106個細(xì)

3、胞，使其在小鼠腹腔內(nèi)誘生大量腹水。收集腹水后，使用抗體亞類鑒定試劑盒對所獲單抗進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示其單抗亞類均為IgG1，輕鏈為κ鏈。接著將獲得的兩株單克隆抗體2D9、2D10純化，最后得到準(zhǔn)度較高的純化產(chǎn)物，利用噬菌體展示隨機(jī)12肽庫對其進(jìn)行生物淘選。分別經(jīng)過3輪淘洗和親和篩選，將最終產(chǎn)物純化，送去測序，最后對測得到的有效序列進(jìn)行比對分析，并分別相應(yīng)獲得8個陽性噬菌體克隆，經(jīng)DNA測序分析，推導(dǎo)和比對，最后分別獲得陽性噬菌體所展示的共有

4、氨基酸序列分別為:173LPAPTS178和184RSND187。通過人工合成目的肽段，通過競爭抑制試驗(yàn)、親和試驗(yàn)和ELISA檢測，證明所合成的多肽能抑制單抗和VP1蛋白的結(jié)合，確認(rèn)序列173LPAPTS178和184RSND187為Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1蛋白的兩個抗原表位。
　　 本研究成功純化了2株純度較高的單克隆抗體2D9、2D10，利用噬菌體展示技術(shù)成功的鑒定了兩株單克隆抗體2D9、2D10的抗原表位，本研究掌握了抗原鑒定