大豆植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的研究.pdf

1、大豆[Glycine max(L.) Merr.]起源于我國(guó)，在中國(guó)已有五千年左右的栽培歷史，它也是世界上重要的糧食和油料作物之一，是人類食物中植物蛋白質(zhì)和油脂的主要來源，與人們的日常生活息息相關(guān)。鑒于大豆的重要性，人們一直利用傳統(tǒng)育種手段來提高大豆的產(chǎn)量。由于受物種間雜交不親和性及不良連鎖等因素影響，使常規(guī)育種方法的應(yīng)用受到限制。近年來，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是植物基因工程技術(shù)的日趨成熟，為大豆的品種改良提供了新的途徑，大豆再生

2、和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。大豆的組織培養(yǎng)再生主要有器官發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生兩種誘導(dǎo)途徑，兩種發(fā)生途徑具有不同的遺傳基礎(chǔ)，同時(shí)需要與不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)基因工作。本研究擬對(duì)大豆器官發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生兩種再生途徑分別進(jìn)行植株再生技術(shù)、再生特性遺傳基礎(chǔ)以及相應(yīng)遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究，由于時(shí)間和條件的限制，部分實(shí)驗(yàn)未取得成功結(jié)果。目前所獲的主要內(nèi)容包括大豆的器官發(fā)生、體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生；大豆再生能力相關(guān)性狀的QTL定位

3、；大豆體細(xì)胞胚胎受體蛋白激酶基因的克隆和功能鑒定；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化和應(yīng)用。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.大豆植株再生技術(shù)體系方面：
　　 (1)以大豆子葉節(jié)為外植體對(duì)25份資源進(jìn)行再生能力和叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種間再生頻率有很大差異，其中N23676、N25277和N00060相對(duì)較高，分別是90.35％、86.53％和84.48％;添加不同激素種類(6-BA、2

4、，4-D和TDZ)的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)大豆子葉節(jié)的叢生芽誘導(dǎo)率也不同，只添加1.67mg/L6-BA就可以得到較高的叢生芽誘導(dǎo)率。
　　 (2)以大豆未成熟子葉為外植體對(duì)98份中國(guó)大豆資源進(jìn)行了體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力的篩選，同時(shí)研究了不同甘露醇濃度、不同ABA濃度和不同外植體大小等三個(gè)因子對(duì)大豆體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力和植株再生能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同基因型之間體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力具有明顯差異，基因型N25281、N25263和N06499

5、具有較高的體細(xì)胞胚發(fā)生能力；選取4-5mm大小的外植體，基本培養(yǎng)基添加5mg/LABA和3.0％甘露醇的組合可以提高大豆的體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力，基因型N25281表現(xiàn)出較高的再生率(82.95％)，平均每個(gè)外植體出苗數(shù)為1.35。
　　 2.大豆再生特性的遺傳基礎(chǔ)：
　　 (1)利用國(guó)家大豆改良中心提供的重組自交家系群體(NJRIKY)，開展了大豆幼胚培養(yǎng)再生能力的QTL遺傳定位研究。該群體的遺傳圖譜該群體的遺傳圖譜共整合

6、了834個(gè)標(biāo)記，分布在24個(gè)連鎖群上，覆蓋大豆基因組2307.83cM，每個(gè)連鎖群上平均34.75個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間的平均距離為2.77cM。選用大豆愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率作為反映大豆幼胚培養(yǎng)再生能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)進(jìn)行QTL分析，結(jié)果共檢測(cè)到3個(gè)與出愈率有關(guān)的QTL，位于B2和D2連鎖群上，可解釋5.84％-16.60％的表型變異；檢測(cè)到4個(gè)與體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率有關(guān)的QTL，全部位于G連鎖群上，對(duì)表型性狀變異的

7、解釋率為7.79％-14.16％。大豆幼胚培養(yǎng)再生性狀的QTL定位研究為大豆再生性狀的改良提供了標(biāo)記輔助選擇的依據(jù)。
　　 (2)從大豆中克隆了1個(gè)編碼體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)的類受體蛋白激酶(GmSERK1)基因，該基因編碼624個(gè)氨基酸，與其它的SERK蛋白具有很高的同源性，其中包括有SP、ZIP、SPP、TM、LRR、胞內(nèi)激酶活性結(jié)構(gòu)域以及C端結(jié)構(gòu)域，同時(shí)該基因也具有與其它SERK家族基因相似的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)特征。系統(tǒng)發(fā)育分析

8、表明植物SERK蛋白有三個(gè)分支，GmSERK1蛋白所在的分支主要由雙子葉植物組成，該蛋白與豆科模式植物蒺藜苜蓿中的MtSERK1蛋白親緣關(guān)系最近。Southem blot分析表明GmSERK1基因在大豆基因組中有1個(gè)拷貝。組織表達(dá)譜分析表明GmSERK1基因在葉、花芽和未成熟子葉中有表達(dá)，但是在根和莖中基本上不表達(dá)。在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，GmSERK1基因在早期培養(yǎng)時(shí)就有表達(dá)，在15天時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，15天后該基因的表達(dá)量反而開始降低，同

9、時(shí)該基因在胚狀物中有很高的表達(dá)量，而在非胚狀物中檢測(cè)不到表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)分析表明在受到甘露醇、ABA、JA和SA等處理后，GmSERK1基因的表達(dá)方式不盡相同。采用Gateway技術(shù)構(gòu)建了GmSERK1基因與GFP融合的過量表達(dá)載體并利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)方法對(duì)GmSERK1蛋白進(jìn)行了的定位研究，結(jié)果表明該蛋白被定位到細(xì)胞膜上，屬于膜結(jié)合蛋白。
　　 3.大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系：
　　 對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體

10、系的主要因素進(jìn)行了研究，包括外植體侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、超聲波處理以及AgNO3處理等，結(jié)果表明30分鐘侵染時(shí)間、共培養(yǎng)3天和10秒超聲波處理可以提高轉(zhuǎn)化效率，在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入2mg/LAgNO3可以提高叢生芽誘導(dǎo)率；利用該遺傳轉(zhuǎn)化方法，將編碼逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的小麥TaNHX2基因?qū)氪蠖梗琍CR檢測(cè)結(jié)果顯示TaNHX2基因已經(jīng)整合到了大豆基因組中，在250mmol/L NaCl溶液處理下發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)化大豆植株表現(xiàn)出葉片變黃跡象逐漸死亡