煙草野火病菌EZ∷Tn5突變體的構(gòu)建、篩選和突變基因的克隆.pdf

1、構(gòu)建植物病原細菌的突變體庫是其功能基因組學研究不可缺少的重要組成部分,是闡明重要基因功能的重要基礎(chǔ)和前提。煙草野火病是由丁香假單胞菌煙草致病變種(Pseudomonassyringaepv.tabaci)引起的一種重要細菌性病害,野火病菌作為植物病原丁香假單胞種團(P.syringaegroups)里50多個致病變種中的一個代表,其基因組學、分子病理學研究明顯落后于番茄致病變種、丁香致病變種、菜豆致病變種等。為了挖掘野火病菌的致病相關(guān)基

2、因,本研究以煙草野火病菌為材料,采用轉(zhuǎn)座子介導的突變體策略,將TnpTransposomeTM攜帶的EZ::Tn5及kanr基因,通過電轉(zhuǎn)化法插入至煙草野火病菌的基因組DNA中,構(gòu)建野火病菌的EZ::Tn5隨機插入突變體庫,并從中篩選致病性、運動性和產(chǎn)胞外蛋白酶能力變異的突變株。然后通過TAIL-PCR技術(shù)擴增EZ::Tn5插入位點的側(cè)翼序列,為進一步研究和分析插入位點基因奠定基礎(chǔ),同時也為病菌-寄主的分子

3、互作研究提供有效的材料。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用EZ::Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng),通過電轉(zhuǎn)化法分別成功構(gòu)建了煙草野火病菌產(chǎn)野火毒素菌株WT4和不產(chǎn)毒菌株SMX006的EZ::Tn5插入突變體庫。在轉(zhuǎn)化電壓為2400V條件下,煙草野火病菌產(chǎn)毒菌株WT4和不產(chǎn)毒菌株SMX006的轉(zhuǎn)化效率分別為4.2×103,0.8×103cfu·μg-1DNA；在轉(zhuǎn)化電壓為1800V時,煙草野火病菌產(chǎn)毒菌株WT4的轉(zhuǎn)化效率降低至1.64×103cf

4、u·μg-1DNA。通過對突變體進行特異性的PCR鑒定、Kan抗性篩選以及連續(xù)繼代培養(yǎng),結(jié)果表明EZ::Tn5均穩(wěn)定地插入到了煙草野火病菌基因組DNA中。
　　 2.以煙草野火病菌不產(chǎn)毒菌株SMX006的EZ::Tn5突變株為材料,對其進行了致病性、運動性和胞外蛋白酶活性測定,獲得了2個致病力明顯減弱的突變株(H028、H029)、1個運動能力明顯減弱的突變株(H028)、1個運動能力喪失的突變株(H029)、2個產(chǎn)胞外蛋白酶能

5、力明顯減弱的突變株(H046、H047)以及1個胞外蛋白酶缺失的突變株(H045)。
　　 3.為了分析突變株的EZ::Tn5插入拷貝數(shù),首先根據(jù)EZ::Tn5特異性序列設(shè)計PCR引物,并進行PCR、切膠回收、地高辛標記,獲得了地高辛標記的DNA探針。選取煙草野火病菌不產(chǎn)毒菌株SMX006突變體表型發(fā)生變化(H028、H029、H045、H046)和表型沒有發(fā)生明顯變化的突變株(H025、H031、H048、H071),分別提取

6、其基因組DNA,并進行HindⅢ限制性內(nèi)切酶消化。Southern雜交結(jié)果表明所有供試的8個EZ::Tn5突變株DNA中EZ::Tn5轉(zhuǎn)座子均為單位點插入。
　　 4.通過TAIL-PCR方法,擴增到了8個突變株的EZ::Tn5插入位點側(cè)翼序列并進行了測序,通過Blast比對,發(fā)現(xiàn)7個突變體基因組中EZ::Tn5的插入位點均位于23SrRNA或16SrRNA基因上,而且插入方向都是順向。僅有1個突變體的EZ::Tn5插入位點不在