煙草野火病菌EZ∷Tn5突變體的構(gòu)建、篩選和突變基因的克隆.pdf

1、構(gòu)建植物病原細(xì)菌的突變體庫是其功能基因組學(xué)研究不可缺少的重要組成部分,是闡明重要基因功能的重要基礎(chǔ)和前提。煙草野火病是由丁香假單胞菌煙草致病變種(Pseudomonassyringaepv.tabaci)引起的一種重要細(xì)菌性病害,野火病菌作為植物病原丁香假單胞種團(tuán)(P.syringaegroups)里50多個(gè)致病變種中的一個(gè)代表,其基因組學(xué)、分子病理學(xué)研究明顯落后于番茄致病變種、丁香致病變種、菜豆致病變種等。為了挖掘野火病菌的致病相關(guān)基

2、因,本研究以煙草野火病菌為材料,采用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的突變體策略,將TnpTransposomeTM攜帶的EZ::Tn5及kanr基因,通過電轉(zhuǎn)化法插入至煙草野火病菌的基因組DNA中,構(gòu)建野火病菌的EZ::Tn5隨機(jī)插入突變體庫,并從中篩選致病性、運(yùn)動(dòng)性和產(chǎn)胞外蛋白酶能力變異的突變株。然后通過TAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增EZ::Tn5插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列,為進(jìn)一步研究和分析插入位點(diǎn)基因奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為病菌-寄主的分子

3、互作研究提供有效的材料。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用EZ::Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng),通過電轉(zhuǎn)化法分別成功構(gòu)建了煙草野火病菌產(chǎn)野火毒素菌株WT4和不產(chǎn)毒菌株SMX006的EZ::Tn5插入突變體庫。在轉(zhuǎn)化電壓為2400V條件下,煙草野火病菌產(chǎn)毒菌株WT4和不產(chǎn)毒菌株SMX006的轉(zhuǎn)化效率分別為4.2×103,0.8×103cfu·μg-1DNA；在轉(zhuǎn)化電壓為1800V時(shí),煙草野火病菌產(chǎn)毒菌株WT4的轉(zhuǎn)化效率降低至1.64×103cf

4、u·μg-1DNA。通過對(duì)突變體進(jìn)行特異性的PCR鑒定、Kan抗性篩選以及連續(xù)繼代培養(yǎng),結(jié)果表明EZ::Tn5均穩(wěn)定地插入到了煙草野火病菌基因組DNA中。
　　 2.以煙草野火病菌不產(chǎn)毒菌株SMX006的EZ::Tn5突變株為材料,對(duì)其進(jìn)行了致病性、運(yùn)動(dòng)性和胞外蛋白酶活性測(cè)定,獲得了2個(gè)致病力明顯減弱的突變株(H028、H029)、1個(gè)運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱的突變株(H028)、1個(gè)運(yùn)動(dòng)能力喪失的突變株(H029)、2個(gè)產(chǎn)胞外蛋白酶能

5、力明顯減弱的突變株(H046、H047)以及1個(gè)胞外蛋白酶缺失的突變株(H045)。
　　 3.為了分析突變株的EZ::Tn5插入拷貝數(shù),首先根據(jù)EZ::Tn5特異性序列設(shè)計(jì)PCR引物,并進(jìn)行PCR、切膠回收、地高辛標(biāo)記,獲得了地高辛標(biāo)記的DNA探針。選取煙草野火病菌不產(chǎn)毒菌株SMX006突變體表型發(fā)生變化(H028、H029、H045、H046)和表型沒有發(fā)生明顯變化的突變株(H025、H031、H048、H071),分別提取

6、其基因組DNA,并進(jìn)行HindⅢ限制性內(nèi)切酶消化。Southern雜交結(jié)果表明所有供試的8個(gè)EZ::Tn5突變株DNA中EZ::Tn5轉(zhuǎn)座子均為單位點(diǎn)插入。
　　 4.通過TAIL-PCR方法,擴(kuò)增到了8個(gè)突變株的EZ::Tn5插入位點(diǎn)側(cè)翼序列并進(jìn)行了測(cè)序,通過Blast比對(duì),發(fā)現(xiàn)7個(gè)突變體基因組中EZ::Tn5的插入位點(diǎn)均位于23SrRNA或16SrRNA基因上,而且插入方向都是順向。僅有1個(gè)突變體的EZ::Tn5插入位點(diǎn)不在