辣椒疫霉(Phytophthora capsici)10個果膠裂解酶基因克隆及pcpel1的功能研究.pdf

1、辣椒疫病是一種在世界范圍內(nèi)的土傳病害，也是我國辣椒生產(chǎn)上廣泛發(fā)生的主要病害之一，近年來由于集約化種植，重茬嚴(yán)重，導(dǎo)致辣椒疫病日趨嚴(yán)重，引起大幅度減產(chǎn)，給辣椒生產(chǎn)帶來了極大的危害。辣椒疫病病原是辣椒疫霉菌(Phytophthors capsici)，是一種土傳卵菌，以卵孢子或厚垣孢子在土壤病殘?bào)w中越冬，可以存活數(shù)月甚至更長時間，在適宜條件下引起青椒莖腐、根腐和枯萎，寄主范圍廣，給我國的及世界各國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 目前

2、，對于辣椒疫病的防治主要采用化學(xué)防治，而培育抗病品種效果不穩(wěn)定，原因之一是辣椒疫霉具有較強(qiáng)的變異能力。因此，探索辣椒疫霉菌重要的致病因子，研究抗病性生理生化機(jī)制，結(jié)合抗病性遺傳，抗病基因的QTL定位(quantitative trait loci)與基因工程，進(jìn)行抗病性鑒定和抗病育種方面研究成為病害防治的前景。其中細(xì)胞壁降解酶在病害致病關(guān)鍵因子之一，包括角質(zhì)酶(cutinase)，果膠酶(pectinase)，纖維素酶(cellulas

3、e)，半纖維素酶(hemicellulase)，蛋白酶(protease)等。而果膠酶又包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)，果膠甲基酯酶(PME)，果膠裂解酶(PL)。果膠裂解酶(PL)是許多植物病原菌分泌的一種果膠酶，能降解植物細(xì)胞壁，許多病原真菌，卵菌，細(xì)菌在侵染過程都能分泌果膠裂解酶。本文以辣椒疫霉菌為研究對象，克隆了辣椒疫霉果膠裂解酶基因，并進(jìn)行體外表達(dá)研究。 以辣椒疫霉強(qiáng)致病和果膠裂解酶活性高的菌株為實(shí)驗(yàn)材料構(gòu)建的DNA文庫

4、，借助Pool-PCR技術(shù)分離了10個果膠裂解酶基因。對基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)10個pel基因具有較高的同源性，并具有不同數(shù)目的糖基化位點(diǎn)，所編碼的蛋白具果膠裂解酶的保守序列和蛋白活性位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉pel基因與其他疫霉pel基因具高度保守序列，也證明了辣椒疫霉菌在自然界中的分類地位。并且對其中一個基因構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，制備了多克隆抗體，借助蛋白印記雜交驗(yàn)證了重組蛋白的免疫活性，利用RT-PCR技術(shù)檢測了其在發(fā)病辣椒葉片內(nèi)的

5、表達(dá)情況，其具體研究結(jié)果如下： 1、Pool-PCR法篩選基因文庫，分離了10個果膠裂解酶基因 從GenBarlk中下載若干pel基因，同源比對設(shè)計(jì)多對引物，然后進(jìn)行反復(fù)篩選，分離了3個全長和7個非全長基因。將所克隆的10個基因經(jīng)過Blast搜索，結(jié)果顯示全部為果膠裂解酶基因。經(jīng)過DNAman軟件處理分析了這10個基因的基本結(jié)構(gòu)，最大開放閱讀框長度為1200-1800 bp，編碼370-500個氨基酸，預(yù)測氨基酸分子量為

6、37-55kDa。利用SignalP 3.0 setver和NetNGlyc 1.0 servet對這10個基因的信號肽和N糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，信號肽長度一般為21.22個氨基酸，N-端糖基化位點(diǎn)以1個的居多，只有pcpel1基因有6個糖基化位點(diǎn)。10個基因的理論P(yáng)I值差異較大。 2、擴(kuò)增非全長的pcpe1基因 使用兩種方法擴(kuò)增非全長基因的未知端序列： (1)RACE法：將辣椒疫霉菌置于三角瓶進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7天后，

7、收集菌絲。然后液氮研磨，利用Trizol法提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶作用，合成cDNA，作為模板，以通用引物(USP)和基因特異引物(GSP)進(jìn)行第一輪PCR；以第一輪產(chǎn)物做模板，用巢式特異引物(NGSP)和巢式通用引物(NUSP)進(jìn)行第二輪PCR，目的片段回收，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α后，送樣測序。將測序片段拼接后，對其進(jìn)行了初步分析，將兩個非全長的基因補(bǔ)充完整，獲得了理論全長基因。 (2)TAIL-PCR法：將辣椒疫霉菌置

8、于三角瓶進(jìn)行振蕩培養(yǎng)5天后，收集菌絲。然后液氮研磨，利用CTAB法提取總DNA，作為模板，以隨即簡并引物(AD)和基因特異引物(GSP)進(jìn)行第一輪熱不對稱交錯PCR；以第一輪產(chǎn)物做模板，用AD引物與第二輪GSP引物進(jìn)行第二輪PCR，以此類推第三輪，直到得到已知序列的側(cè)翼序列，經(jīng)電泳檢測、PCR產(chǎn)物回收，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a后，送樣測序。將測序片段拼接后，對其進(jìn)行了初步分析，最終將非全長的基因補(bǔ)充完整，獲得了4個基因的理論全長序列

9、。 3、pcpel1的真核表達(dá) 根據(jù)已經(jīng)克隆的pcpel1基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增其成熟肽片斷。重組至酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K/pcpel1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選得到陽性克隆。重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)G418篩選和PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子基因組篩選，得到數(shù)株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，重組蛋白進(jìn)行了特異表達(dá)，分子量大小約

10、為65kDa。 4.RT-PCR和Western Blot 利用SDPH-33接種的4-6葉辣椒葉片，提取發(fā)病葉片的總RNA，合成cDNA。根據(jù)pcpel1的序列設(shè)計(jì)特異性引物，用RT-PCR技術(shù)檢測接種葉片內(nèi)pcpel1的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種后pcpel1在發(fā)病辣椒體內(nèi)均能表達(dá)，其表達(dá)量隨著時間的延長而加強(qiáng)，第七天表達(dá)量最高。通過將酵母分泌的PCPEL1蛋白免疫家兔，制備特異性抗體。Western blot分析結(jié)果