水稻果膠甲基酯酶基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、果膠甲基酯酶(Pectin methylesterase，PME)普遍存在于植物細(xì)胞中，主要起內(nèi)源調(diào)控植物細(xì)胞壁上以及細(xì)胞之間果膠含量的作用，并與植物根邊緣細(xì)胞產(chǎn)生及釋放有關(guān)。果膠甲基酯酶基因是一個基因家族，有些成員具有表達(dá)時空特異性。本研究通過克隆水稻果膠甲基酯酶基因，利用大腸桿菌表達(dá)體系和畢赤酵母表達(dá)體系進(jìn)行PME蛋白的表達(dá)研究，并構(gòu)建了不同的水稻果膠甲基酯酶基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至水稻和擬南芥中，以探究果膠甲基酯酶基因表達(dá)與邊緣細(xì)胞產(chǎn)

2、生和釋放的關(guān)系，以及對植物根尖抗逆境行為的影響。 本研究的主要實驗結(jié)果如下： (1)從水稻中克隆了與根邊緣細(xì)胞釋放相關(guān)的pme基因以及pme基因的抑制區(qū)(pectin methylesterase inhibitor，PI)、PME基因的功能區(qū)(pectin methylesterasedoman，PD)、PME基因的反向序列(anti-pectin methylesterase，AP)。構(gòu)建了四個植物表達(dá)載體：pCAM

3、BIAl3011-OS-pme，pCAMBIAl3011-OS-Anti-pme，oCAMBIAl3011-OS-pmeI-Doman，pCAMBIA13011-OS-pme-Doman，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至水稻和擬南芥，得到轉(zhuǎn)基因株系并得到驗證。 (2)利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-OS-pme，導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)PME蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)分子量

4、及含量，結(jié)果表明大腸桿菌表達(dá)蛋白基本以包涵體形式存在，分子量約為68KDa，與預(yù)期大小相符，并以pET28a載體上的His·tag為抗體通過Western blotting鑒定證實。 (3)利用畢赤酵母表達(dá)體系，構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-OS-pme。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)，在甲醇誘導(dǎo)下獲得PME蛋白的分泌表達(dá)，通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)分子量及含量，結(jié)果表明表達(dá)上清中有輕