辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Pcsda1亞細(xì)胞定位和RxLR效應(yīng)因子功能分析.pdf

1、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）是一種極具破壞性的絲狀植物病原體，其分布廣泛，能夠引起全世界范圍的辣椒疫霉病，對全球農(nóng)業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)具有重要的影響（Fisher et al.,2012）。當(dāng)前辣椒疫霉主要以施用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，但重金屬超標(biāo)、農(nóng)藥殘留等問題日益突出，在解決問題的同時，也給辣椒生產(chǎn)、人類生活健康和生態(tài)環(huán)境安全帶來了巨大的威脅和傷害。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)探索辣椒疫霉菌重要的致病因子及其致病機制越來

2、越成為研究的熱點。
　　提高寄主植物的抗病性是控制辣椒疫霉病的最有效的措施。在辣椒疫霉侵染寄主的過程中，病原菌能夠分泌大量的RxLR效應(yīng)分子，促進(jìn)和破壞寄主植物的抗病反應(yīng)。因此，研究RxLR效應(yīng)分子基因的功能和蛋白結(jié)構(gòu)，對了解辣椒疫霉的致病機制，有效控制辣椒疫霉的侵染具有重要意義。
　　本項研究以本實驗室采集并分離保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33為實驗材料，結(jié)合相關(guān)的研究基礎(chǔ)，對辣椒疫霉菌株SD33中的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Pc

3、sda1和RxLR效應(yīng)分子基因進(jìn)行了如下研究：
　　1、利用生物學(xué)軟件從JGI辣椒疫霉菌基因組數(shù)據(jù)庫中篩選得到Pcsda1基因和RxLR效應(yīng)分子基因核苷酸及氨基酸序列，通過NCBI進(jìn)行BLASTn及BLASTp比對，確定篩選出的基因的正確性。
　　2、從本實驗室保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33中提取的基因組DNA中，克隆Pcsda1基因和RxLR效應(yīng)分子基因；
　　3、利用軟件對Pcsda1基因和RxLR效應(yīng)分子基因

4、進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測和分析。
　　4、將Pcsda1基因融合GFP蛋白在辣椒疫霉SD33中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Pcsda1基因定位在辣椒疫霉SD33的細(xì)胞核中，據(jù)此，可以推測目的基因Pcsda1通過影響辣椒疫霉菌細(xì)胞核的形成和發(fā)育，進(jìn)而影響菌絲及孢子囊的正常生長發(fā)育。
　　5、用鬼筆環(huán)肽染色法檢測Pcsda1基因沉默轉(zhuǎn)化子、過表達(dá)轉(zhuǎn)化子和對照轉(zhuǎn)化子的菌絲和孢子囊時期的肌動蛋白細(xì)胞骨架，發(fā)現(xiàn)沉默轉(zhuǎn)化子和過表達(dá)轉(zhuǎn)化子在菌絲和孢子囊中肌動蛋白

5、的分布不規(guī)則，過表達(dá)轉(zhuǎn)化子中，肌動蛋白的數(shù)量增多，尤其是菌絲中，肌動蛋白變成細(xì)長、棍棒狀、更加明亮。因此，Pcsda1可以調(diào)節(jié)肌動蛋白斑塊和肌動蛋白絲的分布和形態(tài)，尤其是在菌絲中。
　　6、利用pBIN-GFP2表達(dá)載體對辣椒疫霉RxLR效應(yīng)分子進(jìn)行功能研究，在本氏煙中表達(dá)4個候選效應(yīng)分子，發(fā)現(xiàn)其中129113基因可以誘導(dǎo)本氏煙草發(fā)生細(xì)胞死亡，129113、101860可以抑制Bax、INF1、CRN4誘導(dǎo)的過敏性壞死反應(yīng)。

6、>　　7、為了進(jìn)一步研究RxLR的功能，對4個RxLR效應(yīng)分子進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。將129113基因的C端與核輸出信號（NES）和核定位信號（NLS1和NLS2）融合，發(fā)現(xiàn)NLS2、NES都改變了129113的定位而NLS1沒有改變129113的定位。改變129113的定位，影響了其在寄主植物細(xì)胞中的功能。推測129113在植物細(xì)胞中起作用有可能發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。
　　通過本研究，我們可以推測4個RxLR效應(yīng)