2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩77頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、Harpin是由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的一類蛋白類激發(fā)子,它們的共同特征是:富含甘氨酸,熱穩(wěn)定,對蛋白酶敏感,在寄主植物上產(chǎn)生致病性,在非寄主植物葉片上可以誘導(dǎo)Hypersensitiveresponse(HR)或Hypersensitivecelldeath(HCD)。當(dāng)外源使用harpin時,可以誘導(dǎo)多種植物抗病、抗蟲、耐旱,并可促進植物生長,但是,對于harpin多重功能的分子機理,目前還不清楚,為深入研究harpin信號在植

2、物體內(nèi)傳導(dǎo)的機制,選取了目前研究較多的由水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae的HpaGXoo和薔薇科植物火疫病的病原細(xì)菌Erwiniaamylovora產(chǎn)生的HrpNEa作為研究對象,產(chǎn)生了表達HpaGXoo的轉(zhuǎn)基因擬南芥,并測定了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病防衛(wèi)反應(yīng);同時,為了確定HrpNEa誘導(dǎo)有益表型的廣譜性,研究了HrpNEa在甜瓜上誘導(dǎo)蚜蟲趨避效應(yīng)。
   1.HpaGXoo在擬南芥中轉(zhuǎn)基因表達促進

3、植物生長和抗病性
   我們將編碼HpaGXoo的基因hpaGXoo構(gòu)建到pBI121雙元載體上,通過真空花絮滲透法轉(zhuǎn)入擬南芥,獲得表達HpaGXoo的擬南芥(HpaGXoo-expressingArabidopsis,HEAT1)轉(zhuǎn)基因系。對轉(zhuǎn)基因系進行了以下分子驗證:通過PCR方法,確定了hpaGXoo基因穩(wěn)定整合在擬南芥基因組中;RT-PCR證明了hpaGXoo基因在擬南芥中可以轉(zhuǎn)錄;從轉(zhuǎn)基因擬南芥中提取的HpaGXoo蛋

4、白能夠在煙草上誘導(dǎo)HR;同時根據(jù)SDS-PAGE電泳,明確了轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達的HpaGXoo蛋白的大小沒有改變(15.6kD)。這些結(jié)果表明,hpaGXoo基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)可以正常翻譯為有活性的、完整的HpaGXoo分子。另外,我們對轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同株系進行抗病性實驗,選擇了具有一定代表性的細(xì)菌菌株P(guān).syringaepv.tomatoDC3000接種擬南芥,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)基因株系都獲得了對該細(xì)菌的抗性。同時對防衛(wèi)反應(yīng)基因N

5、PR1、PR-1和PR3b的表達進行了RT-PCR測定,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因株系中,防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因都有一定增強表達。然后trypanblue染色證明所有的轉(zhuǎn)基因株系都沒有micro-HR的發(fā)生,這種現(xiàn)象與外源噴施擬南芥發(fā)生了不同。根據(jù)以上結(jié)果,我們認(rèn)為HpaGXoo在擬南芥中轉(zhuǎn)基因表達可以促進擬南芥的生長,誘導(dǎo)抗病防衛(wèi)基因的表達,增強對細(xì)菌的抗病性,但不能誘發(fā)micro-HR。另外,是否帶有信號肽對hpaGXoo基因在植物體內(nèi)表達后所誘導(dǎo)的促

6、生長和抗病沒有影響。
   2.HpaGXoo融合蛋白的表達、純化及抗體制備
   HpaGXoo同其他harpin一樣,在植物上可以誘導(dǎo)產(chǎn)生多種效應(yīng),但是對于該蛋白在植物上是如何起作用,在什么部位起作用,目前還不清楚。已有人報道了harpin在植物細(xì)胞中的作用部位,但對不同harpin的研究結(jié)果不盡相同。為了進一步研究HpaGXoo在植物中的作用部位,我們構(gòu)建了可用于HpaGXoo蛋白純化的高效表達載體,原核表達、純化

7、了融合蛋白,并制備了抗血清。我們利用PCR方法從水稻白葉枯病菌的基因組DNA中擴增得到hpaGXoo基因,連接pET30a(+)載體,該載體上保留了蛋白質(zhì)純化所需的Histag編碼序列。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)產(chǎn)生表達菌株。表達菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),提取蛋白進行SDS-PAGE電泳,產(chǎn)生分子量為21.6kD大小的組氨酸標(biāo)記的融合蛋白條帶。利用HisTrapHPKit試劑盒對HpaGXoo融合蛋白進行了純化,并得到21.6k

8、D大小的單一條帶。該純化蛋白可以在煙草上引起典型的過敏性反應(yīng),我們將純化的HpaGXoo蛋白免疫家兔,獲得了HpaGXoo蛋白的多克隆抗體,間接ELISA方法測定抗血清的效價達到1:16,000以上。同時利用Westernblot對蛋白與抗體之間的特異性結(jié)合進行了驗證,結(jié)果表明,不論是粗蛋白還是純化蛋白在相應(yīng)的位置上都有很強的雜交信號,而空載體提取物在相應(yīng)的位置沒有任何信號。我們提取了植物中表達的HpaGXoo蛋白,并對其進行了雜交分析

9、,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植物中表達的HpaGXoo蛋白和原核表達的一樣可以和抗血清特異性識別并產(chǎn)生較強的雜交信號,由于該蛋白原核表達融合了his-tag,故比植物中表達的蛋白條帶大,因此雜交信號不在一條直線上。
   3.HrpNEa在甜瓜上誘導(dǎo)韌皮部防衛(wèi)和蚜蟲趨避效應(yīng)
   植物韌皮部相關(guān)防衛(wèi)(plantphloem-baseddefense,PBD)能夠抵抗刺吸式昆蟲的取食。已知HrpNEa類生物激發(fā)子能夠激發(fā)抗蟲信號傳導(dǎo)

10、途徑,可能參與了韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)的誘導(dǎo),但是HrpNEa的這種誘導(dǎo)抗蟲性是否在其他植物上有廣譜性還沒有證實。RT-PCR及化學(xué)發(fā)光實驗結(jié)果證明HrpNEa處理后可以增加在韌皮部產(chǎn)生韌皮部相關(guān)蛋白的表達及胼胝質(zhì)的沉積,兩者共同構(gòu)成了PBD反應(yīng),并且有利于蚜蟲驅(qū)避、減少蚜蟲在韌皮部的取食活動;對甜瓜野生型和HrpNEa處理的植株蚜蟲趨避效應(yīng)以及蚜蟲刺吸電子信號分析,結(jié)果表明蚜蟲更喜好取食對照植株;此外,HrpNEa處理增加了蚜蟲對葉片的試探性

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論