外源CpTI基因在轉(zhuǎn)基因蘋果中的表達及特性.pdf

1、蘋果是世界上最重要的果樹樹種之一。蘋果轉(zhuǎn)基因研究開始于1989年，隨后相繼有蘋果砧木、品種基因轉(zhuǎn)化成功報道，但研究多集中于基因轉(zhuǎn)化，關(guān)于外源基因在轉(zhuǎn)化植株中的表達、特性以及外源基因在轉(zhuǎn)化系中的遺傳規(guī)律等研究尚少，開展此方面研究將加速轉(zhuǎn)基因蘋果在生產(chǎn)中的應(yīng)用和推廣。 本試驗以轉(zhuǎn)豇豆胰蛋白酶抑制劑(Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI)基因蘋果(Malus domestica Borkh．)(包括皇家嘎拉、王林

2、、喬納金和紅富士60個株系)為試材，應(yīng)用PCR、RT-PCR、熒光原位雜交、室內(nèi)蟲試等方法，研究了外源CpTI基因在蘋果轉(zhuǎn)化組培苗中DNA、RNA和蛋白等水平的表達：應(yīng)用轉(zhuǎn)基因花粉培養(yǎng)、果實蛋白毛細管區(qū)帶電泳等方法，研究了轉(zhuǎn)基因蘋果花粉和果實的特性；通過雜交授粉試驗，研究了外源基因在轉(zhuǎn)基因蘋果中的遺傳規(guī)律：通過試管微嫁接方法，研究了標記基因在蘋果砧穗間的傳導(dǎo)性。主要研究結(jié)果如下： 1.在60個常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年的轉(zhuǎn)CpTI基因

3、蘋果轉(zhuǎn)化株系中均可檢測出CpTI特異基因片斷：除2個轉(zhuǎn)化株系在50 mg/L卡那霉素濃度下出現(xiàn)花葉現(xiàn)象，表現(xiàn)缺乏卡那霉素抗性外，其他株系在含相同濃度卡那霉素的培養(yǎng)基中生長正常。 2.通過對FISH的相關(guān)技術(shù)參數(shù)研究，初步建立了節(jié)果染色體制備和熒光原位雜交技術(shù)體系。以CpTI基因片斷為探針，利用該體系在蘋果細胞核上成功檢出了熒光雜交信號，表明外源基因整合到了轉(zhuǎn)基因蘋果的基因組中。 3.部分轉(zhuǎn)CpTI基因蘋果株系有較強的殺蟲

4、和抑蟲作用。60個轉(zhuǎn)化株系中有2個株系蟲試校正死亡率為100％；28個株系校正死亡率為正值，其中11個株系校正死亡率大于等于50％，經(jīng)秩合檢驗分析，有4個轉(zhuǎn)化株系的蟲重與對照蟲重相比差異顯著，表明其有明顯抑制幼蟲生長發(fā)育的作用。 4.喂食轉(zhuǎn)CpTI基因蘋果組培苗葉片的棉蛉蟲體內(nèi)類胰凝乳蛋白酶活性變化結(jié)果表明：不同轉(zhuǎn)基因株系對蟲體內(nèi)類胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用存在差異，分別表現(xiàn)為抑制能力較強、較弱或沒有抑制能力。其中有9個株系能顯

5、著抑制棉蛉蟲幼蟲體內(nèi)類胰凝乳蛋白酶活力，表明這些株系具有較好的抑制幼蟲生長發(fā)育的作用。 5.對60個轉(zhuǎn)化株系蘋果組培苗進行RT-PCR檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入的外源CpTI基因在43個株系中得到了較高水平的表達，在17個株系中表達強度低。外源基因在轉(zhuǎn)化株系(嘎拉32)中高效表達，經(jīng)RT-PCR擴增，片斷回收，克隆，測序，外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中核苷酸表達與Phaseolus vulgaris trypsin proteinase inh

6、ibitor gene和Tieganqing trypsin inhibitor(TI)gene有100％同源性，蛋白表達與proteinase inhibitor-cowpea有100％同源性。 6.優(yōu)化的適宜蘋果葉片蛋白質(zhì)毛細管電泳程序為：采用改良丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)，電泳過程中溫度為25℃，電壓為20 kV，0.5 psi進樣5 s，電泳時間為17 min，檢測波長在280 nm處的蛋白質(zhì)區(qū)帶。電泳結(jié)果表明：與對照相比有4

7、個嘎拉轉(zhuǎn)化株系在第7.65 min分別出現(xiàn)一條特異吸收峰帶。 7.轉(zhuǎn)基因蘋果花粉離體萌發(fā)率(24.47％)低于對照(62.05％)，但轉(zhuǎn)基因花粉對卡那霉素的抗性高于對照。掃描電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入對蘋果花粉粒形態(tài)、大小、紋飾等方面產(chǎn)生明顯的影響。 8.轉(zhuǎn)基因嘎拉大部分果實中可以檢測到nptⅡ酶活性，但不同果實中的nptⅡ酶活性強度有差異，其中nptⅡ酶活性較強的占71.43％，較弱的占21.43％，檢測不到的占7.

8、14％；果實蛋白毛細管區(qū)帶電泳檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因節(jié)果嘎拉果實中蛋白種類少于對照。 9.以嘎拉轉(zhuǎn)化株系與未轉(zhuǎn)化富士蘋果進行雜交，對果實種胚培養(yǎng)并利用卡那霉素抗性和PCR檢測外源基因存在狀況，結(jié)果表明雜交實生后代外源基因分離比例1：1，符合由一對顯性基因控制的遺傳性狀的自由分離規(guī)律，表明外源基因為一顯性基因，呈單點顯性遺傳。 10.轉(zhuǎn)基因組培苗微嫁接接穗以選用繼代培養(yǎng)30 d左右，帶有2～4片葉片的新梢為宜；適當提高BA濃