假儉草種質(zhì)遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建及重要性狀QTL定位.pdf

1、假儉草（Eremochloa ophiuroides）是禾本科蜈蚣草屬多年生暖季型草坪草，是蜈蚣草屬中唯一用作草坪草的物種。由于起步較晚，假儉草在遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位、性狀的遺傳分析、遺傳多樣性分析及核心種質(zhì)構(gòu)建等領(lǐng)域的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它植物。本研究對(duì)148份假儉草種源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上初步構(gòu)建了假儉草的核心種質(zhì);以兩份外部性狀存在差異且遺傳距離較遠(yuǎn)的假儉草種源為親本配置雜交組合;在對(duì)雜交后代重要的外部性狀（包括營(yíng)養(yǎng)

2、性狀和生殖性狀）進(jìn)行觀測(cè)的基礎(chǔ)上，利用“主基因+多基因混合遺傳模型”分析方法對(duì)這些性狀進(jìn)行了遺傳分析;以F1后代為作圖群體，采用擬測(cè)交作圖策略，構(gòu)建了假儉草的遺傳圖譜;同時(shí)應(yīng)用WinQTLCart軟件結(jié)合構(gòu)建的遺傳圖譜對(duì)控制這些性狀的QTL進(jìn)行了定位。具體研究結(jié)果如下:
　　 1.假儉草種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及核心種質(zhì)的初步建立
　　 1.1 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化假儉草SRAP-PCR反應(yīng)體系以假儉草葉片DNA為模板，采用正交試

3、驗(yàn)設(shè)計(jì)，以Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶四種因素三個(gè)水平，對(duì)假儉草SRAP反應(yīng)體系進(jìn)行研究，并比較了不同濃度模板DNA對(duì)擴(kuò)增效果的影響，建立了假儉草的SRAP最佳反應(yīng)體系。結(jié)果表明，假儉草SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系為:2μ(l)10×PCR buffer、60ng模板DNA、Mg2+1.50mmol·L-1、dNTP260μ mol·L-1、引物0.25μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.5U，總體積為20μl。

4、各因素對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果均有不同影響，其中以Mg2+濃度影響最大，Taq DNA聚合酶的影響最小。這一體系的建立為今后利用SRAP標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行假儉草分子遺傳學(xué)研究提供了科學(xué)的依據(jù)。
　　 1.2 假儉草種質(zhì)資源遺傳多樣性分析應(yīng)用27對(duì)SRAP分子標(biāo)記對(duì)148份假儉草種源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明:(1)27對(duì)SRAP引物共擴(kuò)增出461個(gè)位點(diǎn)，其中具有多態(tài)性的位點(diǎn)有397個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率為86.12％; Nei's遺傳多樣性指數(shù)

5、為0.2821;Shannon信息指數(shù)為0.4282，表明假儉草具有較高的遺傳多樣性水平;(2)假儉草種源各群體的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，各群體的遺傳多樣性由高到低的順序依次為安徽群體＞湖南群體＞江蘇群體＞廣東群體＞河南群體＞浙江群體＞貴州群體＞四川群體＞福建群體＞重慶群體＞江西群體＞廣西群體＞美國(guó)群體＞湖北群體;(3)群體間遺傳關(guān)系分析表明，25.29％的遺傳變異存在于群體之間，74.71％的變異存在于群體內(nèi)，群體間的基因流為1.47

6、69，表明假儉草種源的遺傳變異在很大程度上存在于群體內(nèi)。各群體間UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果表明，安徽與江蘇群體最先聚類(lèi)，湖北群體與其它群體最后聚在一起，來(lái)自相鄰省份的群體有優(yōu)先聚類(lèi)的趨勢(shì);(4)148份假儉草種源的UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果表明，假儉草種源并沒(méi)有按照地理位置進(jìn)行嚴(yán)格的聚類(lèi)，各地種源有交叉聚類(lèi)現(xiàn)象，但各小組內(nèi)有按地理位置聚類(lèi)的趨勢(shì)，表明假儉草種源的遺傳距離與其地理分布有一定的相關(guān)性。
　　 1.3 假儉草核心種質(zhì)的初步建立

7、根據(jù)SRAP分子聚類(lèi)結(jié)果，對(duì)148份假儉草種源分別采取聚類(lèi)-分組法、產(chǎn)地分組-聚類(lèi)分組法和逐步聚類(lèi)法進(jìn)行核心種質(zhì)的選擇，比較了不同取樣方法及取樣比例的15個(gè)樣本群的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)百分率、觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei's遺傳多樣性指數(shù)和Shannon's信息指數(shù)等參數(shù)，最終選擇了43個(gè)樣本組成的樣本群作為核心種質(zhì)。對(duì)初始種質(zhì)和核心種質(zhì)群體的觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei's遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)

8、分別作t測(cè)驗(yàn)，可以看出核心種質(zhì)保留了初始種質(zhì)29.7％的樣品，多態(tài)位點(diǎn)和多態(tài)位點(diǎn)百分率保留率達(dá)到98.74％，觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei's遺傳多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)的保留率分別為98.72％、100.91％、101.45％、101.19％，可見(jiàn)核心種質(zhì)能很好的代表初始種質(zhì)。
　　 2.假儉草重要性狀的遺傳分析
　　 2.1 假儉草雜交后代真實(shí)性鑒定及多態(tài)性SRAP引物篩選以假儉草兩親本(E102

9、、E092(1)及其雜交后代為材料，從400對(duì)SRAP引物組合中篩選出具有父本特征帶的引物，選取其中帶型穩(wěn)定、清晰的引物組合進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定，結(jié)果表明:400對(duì)SRAP引物組合中具有多態(tài)性的引物有162對(duì)，占供試引物的40.5％，162對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增出288個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)為1.78個(gè);兩個(gè)親本間具有父本特征帶的引物組合共有36對(duì)，應(yīng)用6對(duì)SRAP引物（303、297、283、180、332和358）對(duì)雜種后

10、代進(jìn)行了雜種真實(shí)性鑒定，其中真雜種數(shù)目為89個(gè).上述鑒定的假儉草真雜種和多態(tài)性SRAP引物可以用于構(gòu)建假儉草遺傳連鎖圖譜及重要性狀的QTL定位等研究。
　　 2.2 假儉草營(yíng)養(yǎng)性狀的遺傳分析選用假儉草兩份營(yíng)養(yǎng)性狀存在差異的種源材料E102和E092(1)進(jìn)行雜交，獲得F1分離群體，應(yīng)用植物數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型分析方法對(duì)F1群體的葉片長(zhǎng)度與寬度、節(jié)間長(zhǎng)度與直徑、草層高度及匍匐莖色等營(yíng)養(yǎng)性狀進(jìn)行遺傳分析，以初步明確假儉

11、草上述性狀的遺傳特性。結(jié)果表明:(1)在調(diào)查的雜交后代的6個(gè)營(yíng)養(yǎng)性狀中，變異系數(shù)由大到小依次為葉片長(zhǎng)度(23.39％)＞匍匐莖色(21.96％)＞節(jié)間長(zhǎng)度(21.89％)＞草層高度(15.32％)＞節(jié)間直徑(7.41％)＞葉片寬度(6.77％)，變異系數(shù)最大的為葉片長(zhǎng)度，最小的為葉片寬度。(2)葉片長(zhǎng)度的最佳遺傳模型為A-1模型，即一對(duì)主基因模型，該主基因表現(xiàn)為加性和部分顯性或超顯性，主基因遺傳率為68.98％;節(jié)間長(zhǎng)度的最佳遺傳模型為

12、A-4模型，一對(duì)主基因模型，該主基因表現(xiàn)為負(fù)向完全顯性，主基因遺傳率為47.37％;草層高度的最佳遺傳模型為B-6模型，即兩對(duì)主基因模型，主基因表現(xiàn)為等顯性模型，主基因遺傳率為47.20％;葉片寬度和節(jié)間直徑的最佳遺傳模型均為A-0模型，即無(wú)主基因模型;匍匐莖色為B-1模型，即兩對(duì)主基因，加性-顯性-上位性模型，主基因遺傳率為99.23％。
　　 2.3 假儉草生殖性狀的遺傳分析及性狀間相關(guān)檢驗(yàn)應(yīng)用植物數(shù)量性狀主基因+多基因混合

13、遺傳模型分析方法對(duì)F1群體的花序密度、生殖枝高度、每穗粒數(shù)和花序長(zhǎng)度等生殖性狀進(jìn)行遺傳分析，以初步明確假儉草上述性狀的遺傳特性。結(jié)果表明:(1)在調(diào)查的雜交后代的4個(gè)生殖性狀中，變異系數(shù)由大到小依次為花序密度(54.10％)＞生殖枝高度(13.17％)＞每穗粒數(shù)(8.92％)＞花序長(zhǎng)度(8.42％)，變異系數(shù)最大的為花序密度，最小的為花序長(zhǎng)度.(2)花序密度的最佳遺傳模型為A-4模型，即一對(duì)主基因模型，該主基因表現(xiàn)為負(fù)向完全顯性，即顯性

14、效應(yīng)等于負(fù)的加性效應(yīng)，主基因遺傳率為60.71％。生殖枝高度的最佳遺傳模型為B-1模型，即兩對(duì)主基因，加性-顯性-上位性模型，主基因遺傳率為93.73％?；ㄐ蜷L(zhǎng)度也是B-1模型，主基因遺傳率為96.79％。每穗粒數(shù)最佳遺傳模型均為A-0模型，即無(wú)主基因模型，性狀間相關(guān)分析結(jié)果表明，葉片長(zhǎng)度與葉片寬度、葉片長(zhǎng)度與草層高度之間呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.4178和0.6285;生殖枝高度與花序密度、生殖枝高度與每穗粒數(shù)之間呈現(xiàn)顯著

15、的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.3748和0.3562;生殖枝高度與草層高度之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.4230。
　　 3.假儉草遺傳圖譜構(gòu)建和重要性狀QTL定位研究
　　 3.1 假儉草遺傳圖譜的構(gòu)建以89個(gè)假儉草F1后代為作圖群體，利用SRAP標(biāo)記和小麥EST-SSR標(biāo)記，按照擬測(cè)交作圖策略，構(gòu)建了第一張假儉草遺傳圖譜。母本遺傳圖譜定位了89個(gè)標(biāo)記，包括9個(gè)連鎖群，圖譜總長(zhǎng)為1209.08cM，平均圖距為13.

16、74cM，標(biāo)記間最大圖距為38cM，最小圖距為1.1cM，圖距超過(guò)20cM的空隙16個(gè)，分布在3個(gè)連鎖群上。父本遺傳圖譜定位了81個(gè)標(biāo)記，包括12個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)為1238.03cM，平均圖距為15.48cM，標(biāo)記間最大圖距為38cM，最小圖距為1.16cM，圖距超過(guò)20cM的空隙18個(gè)，分布在8個(gè)連鎖群上。本研究構(gòu)建的遺傳圖譜可以為今后構(gòu)建高密度假儉草遺傳圖譜、重要性狀的QTL定位、比較基因組研究以及開(kāi)展分子標(biāo)記輔助育種研究提供科學(xué)依據(jù)

17、。
　　 3.2 假儉草重要性狀QTL定位研究應(yīng)用WinQTLCart軟件，采用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)控制假儉草10個(gè)重要外部性狀的QTL進(jìn)行了定位，除匍匐莖色未檢測(cè)到QTL外，共檢測(cè)到控制9個(gè)性狀的27個(gè)QTL。母本遺傳圖譜上定位了8個(gè)性狀的18個(gè)QTL，父本圖譜上定位了6個(gè)性狀的9個(gè)QTL。葉片長(zhǎng)度共檢測(cè)到6個(gè)QTL，其中3個(gè)位于母本圖譜，3個(gè)位于父本圖譜上。葉片寬度共檢測(cè)到5個(gè)QTL，其中母本圖譜上檢測(cè)到4個(gè)QTL，父本圖譜上檢

18、測(cè)到1個(gè)QTL。節(jié)間長(zhǎng)度共檢測(cè)到4個(gè)QTL，全部定位在母本圖譜上。節(jié)間直徑檢測(cè)到1個(gè)QTL，位于母本圖譜上。草層高度檢測(cè)到2個(gè)QTL，分別位于母本和父本圖譜上?；ㄐ蛎芏葯z測(cè)到4個(gè)QTL，其中母本圖譜上2個(gè)，父本圖譜上2個(gè)。生殖枝高度僅檢測(cè)到1個(gè)，位于父本圖譜上?；ㄐ蜷L(zhǎng)度檢測(cè)到3個(gè)QTL，其中母本圖譜上檢測(cè)到2個(gè)，父本圖譜上1個(gè).每穗粒數(shù)僅檢測(cè)到1個(gè)QTL，位于母本圖譜上。本研究結(jié)果可以為假儉草相關(guān)性狀的標(biāo)記輔助育種和遺傳改良研究提供理論