小鼠睪丸特異性hsp70基因原核表達(dá)及mRNA分析的研究.pdf

1、Hsp70-2和Hsc70t是小鼠睪丸特異性表達(dá)的兩種熱休克蛋白70家族成員，它們均在精子發(fā)生的減數(shù)分裂期表達(dá)。為進(jìn)一步研究其功能，本研究根據(jù)Genbank中小鼠的hsp70-2和hsc70t的cDNA序列設(shè)計了特異性引物，以由睪丸中提取的總DNA為模板，采用PCR方法克隆其基因序列，利用DNAStar等軟件對其進(jìn)行序列和抗原表位分析;利用內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切hsp70-2基因，將切下的目的片段插入pET-32a(+)載體，

2、構(gòu)建pET-32a(+)/hsp70-2重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性后，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并摸索最佳的誘導(dǎo)條件。通過SDS-PAGE電泳和Westernblot對重組蛋白進(jìn)行分析和鑒定，并利用親和層析提純蛋白。以昆明雄性小鼠為受試動物，分別用近似陰囊溫度(33℃)、腹溫(37℃)和超高溫(42℃)三個溫度組，應(yīng)激處理4h，然后提取睪丸總RNA，以18SrRNA引物作為內(nèi)標(biāo)，用半定量RT-

3、PCR檢測熱應(yīng)激小鼠睪丸內(nèi)這兩種基因的mRNA的表達(dá)水平。試驗結(jié)果如下:
　　 1.用PCR方法成功克隆了1902bp的小鼠睪丸hsp70-2開放閱讀框（GenBank登錄號為FJ434401），經(jīng)BLAST分析，與GenBank已發(fā)表的序列同源性為99.6％，共有7個位點發(fā)生突變，氨基酸序列同源性為99.2％，蛋白抗原表位預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白72～113(aa)、222～292、494～541、556～605區(qū)域存在優(yōu)勢抗原表

4、位的可能性最大。SDS-PAGE電泳顯示，原核表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量約為90kD，與預(yù)計大小相符，對表達(dá)重組蛋白進(jìn)行可溶性分析，證實該蛋白僅以包涵體形式存在。最佳誘導(dǎo)條件為:0.15mmol/LIPTG，30℃，6h;經(jīng)Westernblot試驗進(jìn)一步證實，該重組蛋白具有小鼠Hsp70-2反應(yīng)原性。
　　 2.用PCR方法成功克隆了1926bp的小鼠睪丸hsc70t開放閱讀框（GenBank登錄號為EU549780），經(jīng)BLAST分析

5、，與GenBank已發(fā)表序列同源性為99.9％，共有2個位點發(fā)生突變，氨基酸序列同源性為99.9％，蛋白抗原表位預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白30～42(aa)、154～165、245～370、494～605區(qū)域存在優(yōu)勢抗原表位的可能性最大。
　　 3.用18SrRNA做內(nèi)標(biāo)對小鼠熱應(yīng)激睪丸內(nèi)兩種基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量分析顯示:隨著熱應(yīng)激溫度的升高，小鼠睪丸hsp70-2mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降，且各熱應(yīng)激組均顯著(P＜0.05