人和小鼠睪丸特異性表達基因譜分析.pdf

1、本研究通過比較小鼠4、9、18、35、54日齡和6月齡小鼠睪丸，人胚胎期和成人睪丸的Affymetrix芯片分析的全基因組表達及差異基因表達譜，篩選出人睪丸差異表達3018個基因，小鼠不同日齡睪丸差異表達2058個基因，小鼠差異表達的基因主要出現(xiàn)在9日齡與18日齡、18日齡與38日齡兩組睪丸組織中。運用生物信息學軟件Cluster 3.0做2058個基因的聚類分析(HierarchicalClustering)，將2058個基因分為8個

2、大類。第1類411個基因，如CREM,Testisin,MSJ-1,TPAP,Soggy,Hox a4和mTSARG3；第Ⅱ類76個基因，如CATSPER2和Pgk-2；第Ⅲ類453個基因，如Tnp2,HILs1,SP-10，SPArA6,Ddc8和TESF-1第Ⅳ類112個基因，如SRG4;第Ⅴ類87個基因，如RFX2；第Ⅵ類548個基因，如Tesmin,GRTH,Trif，等。第Ⅶ類362個基因；第Ⅷ類9個基因。2058個基因進行功

3、能分類。按生物學途徑(Biological process)分：生理(Physiological)434個基因；細胞途徑(Cellular process)241個基因；發(fā)育fDevelopment)82個基因；未知途徑(Unknown process)52個基因；調(diào)節(jié)(Regulation)6個基因，行為(Behavior)5個基因，不能分類的(Unclassifiedes)1151個基因。按分子功能(Molecular functi

4、on)分：結(jié)合(Binding)344個基因；催化活性(Catalytic activity)250個基因；信號轉(zhuǎn)導因子(Signal transducer)68個；轉(zhuǎn)運蛋白(Transporter)62個；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(Transcription regulator)53個；未知功能的48個基因；結(jié)構(gòu)分子(Structure molecule)25個；分子伴侶(Chaperone)22個；酶調(diào)節(jié)因子(Enzyme regulator)

5、22個；運動活性(Motor activity)15個；抗氧化劑活性(Antioxidant activity)3個；翻譯調(diào)節(jié)蛋白(Translation regulator)3個；有1439個基因不能被分類。按細胞組分(Cellular component)分：在2058個基因中，411個基因在細胞上表達，124個基因在細胞外表達，未知組分43個，沒定位的6個，還有1 544個基因不能被分類。 從2058個基因中隨機選擇了10

6、個基因，做半定量RT-PCR分析。不同日齡的Balb/C小鼠睪丸內(nèi)，這類基因在早期睪丸中不表達或表達很弱，隨著年齡的增長，其表達逐漸增強。RT-PCR結(jié)果同時也驗證了Affymetrix芯片數(shù)據(jù)的可靠性。根據(jù)小鼠睪丸組織芯片分析數(shù)據(jù)，結(jié)合半定量RT-PCR，篩選出8個新的小鼠睪丸特異性基因(Testis-specific conserved gene，TSC)，按照它們的分子量和生物學活性分別命名為TSC21、TSC23、TSC24、T

7、SC28、TSC31、TSC77、睪丸特異性BAG(Bcl-2 associated athanogene)樣蛋白(Testis-specific BAG-like protein，TSBAG)和睪丸特異性Ⅱ型cAMP依賴性蛋白激酶錨定蛋白(Testis-specificanchoringprotein oftype Ⅱ cAMP-dependentproteinkinase，TSCPA)。采用小鼠和.人同源基因比較分析，找到相應(yīng)的人體

8、同源基因，經(jīng)RT-PCR鑒定，這8個基因也是人體睪丸組織特異性基因。小鼠TSC24(mTSC24,GenBank登錄號：AK006825)基因定位于1號染色體，其cDNA長度899bp，開放閱讀框624 bp，編碼一個207個氨基酸，分子量為23.997kDa。生物信息學分析表明該蛋白可能定位于細胞核中(60.9％)。該基因在小鼠睪丸組織的表達呈年齡依賴性升高，而且為睪丸組織特異性表達。Blast同源比較分析，mTSC24蛋白與黃牛(B

9、os Taurus)TSC24蛋白有57％的同源性，與黑猩猩(Chimpanzee)TSC24蛋白有60％的同源性，與狗(Canis familiaris)TSC24蛋白有40％的同源性，與人hTSC24蛋白有56％的同源性。 人TSC24基因(hTSC24，GenBank登錄號：NM_032126)，開放閱讀框702bp，編碼一個有233個氨基酸、分子量為26.533 kDa的蛋白質(zhì)。RT-PCR證實該基因為人體睪丸組織特異性

10、表達。將hTSC24基因的編碼序列插入真核表達載體DEGFP-C1上EGFP基因表達序列的3’端，構(gòu)建成攜帶GFP-TSC24融合基因表達盒的重組載體pEGFP-C1-GFP-TSC24，運用脂質(zhì)體Lipofactamine 2000將DEGFP-C1-GFP-TSC24轉(zhuǎn)染Cos-7細胞，可見GFP-TSC24融合蛋白分布于細胞核，表明TSC24蛋白與TSC21相似，也定位于細胞核上。該研究結(jié)果發(fā)表在SCI收錄的國際期刊《Biolog

11、ical＆Pharmaceutical Bulletin》2006年第11期(PMID：17077512)。 小鼠TSC21(mTSC21，GenBank登錄號：AK005862)基因定位于染色體6C3位點，其cDNA長度810 bp，開放閱讀框543 bp，編碼一個180個氨基酸，分子量為21.04 kDa的蛋白質(zhì)，生物信息學分析表明該蛋白可能定位于細胞核中。該基因為小鼠睪丸組織特異性表達，且呈年齡依賴性升高。Blast同源比

12、較分析，小鼠mTSC21蛋白與大鼠TSC21蛋白有86％的同源性，與人hTSC21蛋白有70％的同源性。人TSC21基因(hTSC21，15niGene Hs.132104)定位于人染色體2p11-2位點，其cDNA長度797 bp，開放閱讀框542bp，編碼一個由180個氨基酸組成、分子量為20.61 kDa的蛋白質(zhì)。RT-PCR證實該基因為人體睪丸組織特異性表達。將hTSC21，基因的編碼序列插入真核表達載體pEGFP-C1上EGF

13、P基因表達序列的3’端，構(gòu)建攜帶GFP-TSC21融合基因表達盒的重組載體pEGFP-C1-GFP-TSC21，運用脂質(zhì)體Lipofactamine 2000將pEGFP-C1-GFP.TSC21轉(zhuǎn)染Cos-7細胞，可見GFP-TSC21融合蛋白分布于細胞核，表明TSC21蛋白定位于細胞核上。上述研究結(jié)果于2006年發(fā)表在SCI收錄的國際期刊《Molecular Biology Report》(PMID：17091336)。采用RT-P

14、CR的方法，檢測8個睪丸表達特異性新基因TSC21、TSC23、TSC24、TSC28、TSC31、TSC77、TSBAG和TSCPA在正常人、隱睪癥和無精子癥患者睪丸組織的表達。與正常睪丸組織比較，TSC21、TSC23、TSC24、TSC28、TSBAG和TSCPA在隱睪癥和無精子癥患者睪丸組織的表達消失，TSC31的表達明顯減少，而TSC77的表達與正常睪丸組織無顯著差異。該結(jié)果表明，TSC21、TSC23、TSC24、TSC28

15、、TSC31、TSBAG和TSCPA在精子發(fā)生的過程中具有重要作用，這些基因的表達異?？赡芘c隱睪癥或無精子癥的發(fā)生有關(guān)。 篩選和鑒定精子發(fā)生過程中起重要作用的睪丸特異性基因，并對這些基因的表達特性及其在精子發(fā)生過程中所起的生物學功能進行深入研究，對理解精子發(fā)生的內(nèi)在機理、防治由精子發(fā)生異常引起的男性不育、了解男性性功能衰退、研制男性避孕藥及保健藥等具有重要意義。上述研究結(jié)果，無疑為進一步研究這些睪丸特異性基因的生物學功能打下了良