LiCl對(duì)Hcaf細(xì)胞凋亡及HSP70表達(dá)的影響和LiCl、HSP70對(duì)615小鼠的抑瘤作用.pdf

1、前言:熱休克蛋白(HSPs)是生物體在應(yīng)急條件下產(chǎn)生的一組蛋白，又稱為應(yīng)急蛋白(stress protain)，廣泛存在于原核真核生物中，高度保守。目前可分為HSP90、HSP70、HSP60及小HSP60四個(gè)家族。 HSP70在正常細(xì)胞中廣泛存在，多存在于細(xì)胞內(nèi)，正常細(xì)胞中水平較低，應(yīng)激狀態(tài)下顯著增高。但研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤細(xì)胞中HSP70過(guò)表達(dá)。 HSP70在正常細(xì)胞表面不表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞表面的特異性結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)引起腫瘤免疫應(yīng)

2、答的成分是HSP70，而腫瘤細(xì)胞的HSP70序列與正常組織細(xì)胞的HSP70序列幾乎完全相同，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵是HSP70結(jié)合的小肽。由此認(rèn)為來(lái)源于腫瘤細(xì)胞HSP70的腫瘤肽，具有腫瘤免疫作用。
　　 鋰鹽在臨床上主要用于治療精神方面疾病，也可升高外周血中腫瘤壞死因子(TNF)的水平，使細(xì)胞對(duì)TNF介導(dǎo)的凋亡和壞死敏感。鋰鹽有相對(duì)寬泛的安全范圍，?？梢栽谖达@示其毒性的情況下上調(diào)TNF水平。安全、通常不致出現(xiàn)副反應(yīng)是

3、其特點(diǎn)。 HSP70在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖和生存所必需，且可通過(guò)抑制其表達(dá)誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤的增殖。 HSP70與人單核細(xì)胞表面結(jié)合，能刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a等細(xì)胞因子，也可誘導(dǎo)體內(nèi)的T細(xì)胞高表達(dá)TNF-a等細(xì)胞因子，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。
　　 鋰鹽可以升高TNF-α等細(xì)胞因子的水平，并能直接影響c-fos等原癌基因的表達(dá)；而Hcaf細(xì)胞的HSP70攜有腫瘤肽能激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免

4、疫，同時(shí)也可升高IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子的水平，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。本試驗(yàn)對(duì)純系615小鼠的Hcaf腫瘤細(xì)胞，通過(guò)超聲粉碎、層析，梯度洗脫、純化、鑒定，獲得腫瘤來(lái)源的HSP70；并研究不同劑量LiCl對(duì)體外培養(yǎng)的Hcaf細(xì)胞的作用及對(duì)Hcaf細(xì)胞的HSP70表達(dá)的影響；
　　 還通過(guò)應(yīng)用LiCl、Hcaf細(xì)胞的HSP70和健康小鼠組織的HSP70作用于由Hcaf細(xì)胞建立起來(lái)的615小鼠腫瘤模型，觀察小鼠外周血中細(xì)胞因子

5、TNF-α的變化及抗腫瘤效果。
　　 材料與方法:
　　 第一部分實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)對(duì)Hcaf細(xì)胞超聲粉碎，20000r/min，高速冷凍離心1小時(shí)，經(jīng)ConA-sepharose柱層析，收集未結(jié)合部分透析，經(jīng)DEAE柱層析，用FPLC-system梯度洗脫結(jié)合在DEAE柱上的部分，收集各個(gè)峰值的蛋白樣品，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)證明C峰的樣品為分子量70KD的蛋白。經(jīng)過(guò)蛋白免疫印跡(Western-blo

6、tting)驗(yàn)證，此樣品為HSP70。經(jīng)過(guò)純化、冷凍抽干、過(guò)濾除菌，-70℃保存。以備進(jìn)行HSP70的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。第二部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LiCl、HcaF細(xì)胞的HSP70和健康小鼠組織的HSP70作用于由HcaF細(xì)胞建立起來(lái)的615小鼠腫瘤模型，觀察小鼠外周血中細(xì)胞因子TNF-α水平的變化及抗腫瘤效果。第三部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同劑量的LiCl，作用于用RPMI-1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)的Hcaf細(xì)胞的作用，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，分別用碘化丙錠(PI)、兔

7、抗小鼠HSP70抗體和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體染色，觀察Hcaf細(xì)胞周期變化及對(duì)Hcaf細(xì)胞HSP70表達(dá)的影響，并通過(guò)掃描電鏡觀察Hcaf細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分實(shí)驗(yàn)經(jīng)對(duì)HcaF細(xì)胞超聲粉碎、離心、層析，用FPLC-system梯度洗脫，收集各個(gè)峰值樣品，C峰的樣品經(jīng)SDS-PAGE證明為70KD蛋白，經(jīng)Western-blotting驗(yàn)證為HSP70：第二部分給予健康的615小鼠組織的HS

8、P70對(duì)腫瘤組織的抑制作用與對(duì)照組相比差別不顯著；與對(duì)照組比較，LiCl組和Hcaf細(xì)胞HSP70組的抑瘤作用差別顯著，但兩組之間抑瘤作用差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；合用LiCl和Hcaf細(xì)胞HSP70組，抑瘤作用最顯著。正常組織的HSP70注射后TNF-a略升高，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LiCl組，Hcaf細(xì)胞HSP70組的TNF-a升高，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LiCl與Hcaf細(xì)胞HSP70合用組TNF-a升高與單用LiCl，Hcaf

9、細(xì)胞HSP70組比較，無(wú)顯著差別。第三部分實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞8小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)“亞二倍體峰”逐漸增大，G0/1期DNA含量逐漸減少，二倍體峰縮小；G2M期DNA含量升高，四倍體增加；S期的DNA含量也增加，而對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞周期未見(jiàn)“亞二倍體峰”，結(jié)果顯示經(jīng)氯化鋰處理后，Hcaf細(xì)胞發(fā)生周期阻滯；第三部分實(shí)驗(yàn)組的Hcaf細(xì)胞經(jīng)LiCl處理8小時(shí)后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的HSP70平均熒光強(qiáng)度增高，顯示實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組比較HSP70表達(dá)增強(qiáng)

10、。對(duì)照組的熒光強(qiáng)度與單用二抗比較無(wú)明顯升高。氯化鋰(60ug/ml)組作用8小時(shí)，收集的Hcaf細(xì)胞經(jīng)透射電鏡觀察的結(jié)果：顯示Hcaf細(xì)胞體積變大，邊緣可見(jiàn)vi；胞質(zhì)變化不明顯，核大，可見(jiàn)核仁，異染色質(zhì)積聚成團(tuán)塊狀，分布在核仁內(nèi)側(cè)；細(xì)胞邊緣膨出，起泡，Vi；細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.Hcaf細(xì)胞經(jīng)超聲波粉碎，ConA-sepharose柱和DEAE柱層析，洗脫，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

11、、Western-blotting鑒定：FPLC-system洗脫收集得到的C峰蛋白為熱休克蛋白70。
　　 2.LiCl，Hcaf細(xì)胞來(lái)源的HSP70可以升高615小鼠外周血中的TNF-a水平，有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。
　　 3.LiCl和Hcaf細(xì)胞來(lái)源的HSP70合用可以升高615小鼠外周血中的TNF-a水平，抑瘤作用顯著；健康615小鼠組織來(lái)源的HSP70與對(duì)照組比較抑瘤作用不明顯。
　　 4.LiCl對(duì)體