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1、胸腺素β4(Thymosinbeta4,Tβ4)是肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽家族的一員,具有促進(jìn)毛囊發(fā)育,加快毛發(fā)生長(zhǎng)的作用。為了深入了解Tβ4基因?qū)γ野l(fā)育與毛發(fā)生長(zhǎng)的作用,本研究構(gòu)建了表皮特異性表達(dá)載體,并通過(guò)轉(zhuǎn)染阿爾巴斯絨山羊耳尖皮膚成纖維細(xì)胞,驗(yàn)證啟動(dòng)子的表達(dá)能力。通過(guò)原核注射技術(shù),制作轉(zhuǎn)Tβ4基因小鼠,得到PCR陽(yáng)性小鼠,并檢測(cè)陽(yáng)性小鼠尾尖Tβ4基因mRNA水平的表達(dá)量。
1.表皮特異性表達(dá)載體pODsRed-KTP和pCD
2、sRed-KTP的構(gòu)建
本研究構(gòu)建了2個(gè)表皮特異性表達(dá)載體:pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP。pODsRed-KTP以角蛋白14啟動(dòng)子(keratin14promoter,pKRT14)指導(dǎo)Tβ4基因的表達(dá),并以O(shè)ct-4啟動(dòng)子(Oct-4promoter,pOct-4)指導(dǎo)紅色熒光蛋白的表達(dá)。作為對(duì)照載體,pCDsRed-KTP以pKRT14指導(dǎo)Tβ4基因的表達(dá),以CMV啟動(dòng)子(CMVpromoter,pC
3、MV)指導(dǎo)紅色熒光蛋白的表達(dá)。
pKRT14是表皮特異性啟動(dòng)子,指導(dǎo)Tβ4基因在表皮類細(xì)胞中過(guò)表達(dá),使得pODsRed-KTP與pCDsRed-KTP具有表皮特異性。pODsRed-KTP與pCDsRed-KTP區(qū)別在于pODsRed-KTP的紅色熒光蛋白只在部分干細(xì)胞中表達(dá),可以對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行示蹤,而pCDsRed-KTP的紅色熒光蛋白在大量細(xì)胞系中均表達(dá),主要在后續(xù)試驗(yàn)中為pODsRed-KTP做對(duì)照。
2
4、.轉(zhuǎn)染阿爾巴斯絨山羊耳尖皮膚成纖維細(xì)胞驗(yàn)證pKRT14功能
將表皮特異性表達(dá)載體pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP轉(zhuǎn)入阿爾巴斯絨山羊耳尖皮膚成纖維細(xì)胞。以表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)pCDsRed-KTP細(xì)胞為對(duì)照,推測(cè)pODsRed-KTP的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率,約為31%。篩選穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Tβ4基因的細(xì)胞,檢測(cè)Tβ4基因在mRNA水平的表達(dá)情況,與未轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相比,表達(dá)量上調(diào)了4.51倍。結(jié)果表明,pKRT14是有效的,能夠
5、啟動(dòng)Tβ4基因的表達(dá)。
3.轉(zhuǎn)Tβ4基因小鼠的制備與鑒定
通過(guò)原核注射技術(shù)得到50只待檢測(cè)幼鼠,經(jīng)過(guò)PCR鑒定得到4只陽(yáng)性小鼠,包括1只公鼠和3只母鼠,陽(yáng)性小鼠得率為8%。檢測(cè)Tβ4基因在陽(yáng)性小鼠尾尖mRNA水平的表達(dá)量,與正常小鼠比較,陽(yáng)性小鼠的mRNA水平的表達(dá)量介于1.32-2.05倍之間。
本研究制作并初步鑒定了轉(zhuǎn)Tβ4基因小鼠,為進(jìn)一步研究Tβ4基因的功能,探索其作用機(jī)制等相關(guān)研究奠定
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