牛布魯氏菌Omp25基因的克隆與原核表達(dá)及抗原特異性研究.pdf

1、布魯菌(Brucella)是革蘭氏陰性兼性的細(xì)胞內(nèi)寄生菌，是一種由布魯菌引起的人畜共患傳染病,給畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康造成極大的危害。準(zhǔn)確的診斷對(duì)有效控制和消滅布魯菌病是相當(dāng)重要的，探索尋找合適的布魯菌診斷性抗原一直是人們的目標(biāo)，所以具有免疫原性和抗原保護(hù)作用的布魯菌外膜蛋白就成為了研究的熱點(diǎn)。
　　本試驗(yàn)從GeneBank中下載編碼布魯菌外膜蛋白的基因，分析選取目前所有布魯菌基因序列同源性高的基因進(jìn)行研究。通過分析選取了牛布魯

2、氏菌A544的Omp25基因?qū)ζ溥M(jìn)行初步研究，利用PCR方法從流產(chǎn)布魯菌基因組DNA中擴(kuò)增出外膜蛋白基因Omp25，大約642bp的基因片段，將目的基因片段用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I雙酶切后直接與經(jīng)雙酶切的表達(dá)載pGEX-6p-1連接，將該片段克隆于原核表達(dá)載體pGEX-6p-1中，之后將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21。重組載體的菌液經(jīng)PCR鑒定、重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明，成功擴(kuò)增出了目的基因，并且將其成功重組

3、到了表達(dá)載體pGEX-6p-1中，重組菌在0.5 mmol/L的IPTG條件下誘導(dǎo)4 h時(shí)目的蛋白表達(dá)量達(dá)到了高峰。表達(dá)融合蛋白質(zhì)分子量約為49kDa，以包涵體形式存在。
　　提取包涵體后用電洗脫方法純化融合蛋白，經(jīng)western-blotting分析重組表達(dá)融合蛋白Omp25的反應(yīng)原性，發(fā)現(xiàn)該蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫家兔得到了較高效價(jià)的抗血清。進(jìn)而用B.suis S2作為菌體抗原包被,用所制的血清作為一抗，羊抗兔IgG為二抗。進(jìn)