利用毒蛋白基因提高棉花轉(zhuǎn)化效率的研究.pdf

1、用轉(zhuǎn)基因方法將外源目的基因?qū)朊藁ㄊ敲藁ㄟz傳改良的主要途徑，但幾種棉花轉(zhuǎn)基因方法各有其局限性。本研究將農(nóng)桿菌毒蛋白基因（VirD1，VirD2，VkE2），引入EMS，6BA，GA等輔助劑，通過花粉管通道法將GFP與三個(gè)毒蛋白基因一起田間導(dǎo)入棉花。利用三個(gè)毒蛋白基因在棉花授粉時(shí)候瞬時(shí)表達(dá)，并將GFP定位于棉花細(xì)胞核，達(dá)到提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率的目的。本研究主要內(nèi)容如下： ⑴利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中三個(gè)毒蛋白基因（Vr D1、VrD2

2、和VrE2）和EMS，LW77，6BA，GA等輔助劑，應(yīng)用改進(jìn)的微注射法將篩選GFP導(dǎo)入6個(gè)棉花品種，并通過卡那初篩、PCR方法驗(yàn)證和熒光鑒定，提高了棉花的轉(zhuǎn)化效率。 ⑵構(gòu)建了不同細(xì)胞定位的植物表達(dá)載體pBLG-pR1aS-GFP，pblg-sm-gfp，pblg-pa7-gfp，pblg-gfp，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草（NC89），分別獲得了轉(zhuǎn)基因煙草，經(jīng)鑒定定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pblg-pr1aS-gfp的轉(zhuǎn)基因煙草，在熒光倒置顯

3、微鏡下，通過藍(lán)光激發(fā)下，GFP發(fā)出的熒光遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它3個(gè)載體的轉(zhuǎn)基因煙草。 ⑶通過比較農(nóng)桿菌直接注射法、農(nóng)桿菌侵染花粉法、毒蛋白基因的協(xié)助轉(zhuǎn)化法的研究表明：農(nóng)桿菌直接注射法的轉(zhuǎn)化率0.6-1.8％，農(nóng)桿菌侵染花粉法的轉(zhuǎn)化率為0.5-1.8％，毒蛋白基因的協(xié)助轉(zhuǎn)化并且附加EMS，LW77，6BA，GA處理可使棉花轉(zhuǎn)化率達(dá)到2.3-2.8％。 ⑷利用毒蛋白基因改進(jìn)花粉管通道法，提供了一個(gè)新的棉花轉(zhuǎn)基因方法，對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的分子