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文檔簡介
1、背景:基因治療是指通過一定的方法將外源DNA分子導(dǎo)入病人體細(xì)胞并有效表達(dá),從而糾正缺陷性狀和表型,達(dá)到治療疾病的目的。目前應(yīng)用于基因治療的的載體主要包括病毒載體和非病毒載體兩大類.病毒載體和非病毒載體都具有各自的優(yōu)勢,被廣泛的應(yīng)用。病毒載體相對于非病毒載體具有高效的特點。但是病毒載體具有免疫原性和隨機整合等安全性問題,因此非病毒載體相對來說具有獨特的安全性優(yōu)勢。本實驗室所開發(fā)研究的“人源基因載體pHrneo”是一種非病毒載體,前期的臨床
2、前研究證實其可能是一種應(yīng)用于基因治療的有效的打靶載體,但其打靶效率仍有待進一步提高。鋅指酶是一種人工嵌合酶,它能夠通過在基因組的特定位點制造DNA雙鏈斷裂刺激細(xì)胞內(nèi)同源重組,使打靶效率提高5000倍以上,它可能是一種提高人源基因打靶載體打靶效率的有效的工具。 目的:建立體外快速設(shè)計鑒定有效鋅指酶的系統(tǒng);設(shè)計鑒定出能有效切割位于h rDNA區(qū)的打靶位點的鋅指酶,為進一步應(yīng)用于提高人源基因載體打靶效率打下基礎(chǔ)。 方法:1、本
3、研究選擇了3個打靶位點,根據(jù)相關(guān)文獻數(shù)據(jù),設(shè)計了4組鋅指酶(8個鋅指酶單體);2、利用OVER-LAP PER的方法合成鋅指酶基因,并構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體;3、通過TNT-T7快速轉(zhuǎn)錄翻譯試劑盒快速翻譯鋅指酶蛋白,通過與含有靶向位點的DNA質(zhì)粒載體作用,應(yīng)用體外兩步法進行鋅指酶有效性鑒定;4、將所設(shè)計的鋅指酶表達(dá)載體與phr-GFP轉(zhuǎn)染HEK293-T及HL7702細(xì)胞,觀察熒光表達(dá)效率以及細(xì)胞毒性。 結(jié)果:1、通過體外快速鑒定,
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