利用VIGS技術研究棉花三個鋅指蛋白基因的耐逆性.pdf

1、棉花作為一種主要的經濟作物，與國計民生密切相關，在農業(yè)經濟發(fā)展中處于重要地位。我國棉花生產位居世界前列，同時也是最大的棉花消耗國。隨著環(huán)境不斷惡化，干旱、鹽堿、極端溫度等各種非生物逆境危害嚴重制約著棉花產量和品質的提高;全球可耕土地減少，而且近年來，國家調整種植業(yè)產業(yè)結構，棉花種植面積逐年減少。棉花是耐逆性較強的作物，因此進一步提高棉花耐逆能力，是提高土地利用率，保證棉花產量的重要措施。
　　鋅指蛋白(zinc finger pr

2、otein)是一類和鋅離子結合后能折疊成手指狀結構域的轉錄因子，在動植物和微生物中廣泛存在。這類蛋白通過與DNA、RNA結合或與其他蛋白質的相互作用來調控下游基因的表達，其作用貫穿于生命活動的各個過程。鋅指蛋白在植物體內發(fā)揮著重要的作用，可以調節(jié)生長發(fā)育、增強耐病耐逆性等。
　　病毒誘導的基因沉默(VIGS)技術是指在病毒載體中插入一段目的基因序列，利用重組載體侵染宿主植物，使宿主目的基因發(fā)生沉默繼而引起表型變化，通過表型變異進行

3、基因功能分析。該技術可以快速、高效分析植物基因功能。
　　本實驗室前期通過同源克隆方法得到了三個鋅指蛋白基因GhZFP2，GhRCHY1，GhBBX1，通過qRT-PCR對這三個基因進行了逆境誘導表達分析，轉煙草結果表明在煙草中異源表達這三個基因可以提高煙草的耐鹽和耐旱性。本研究基于前期研究結果，進一步構建了三個基因的VIGS載體，利用注射的方法將病毒轉入棉花后進行鹽脅迫和干旱脅迫處理，通過測定相關生理指標進一步來研究這三個基因的

4、功能，同時也構建了與棉花抗逆相關基因的VIGS快速功能驗證體系。主要結果如下:
　　1、通過不同濃度的NaC1和PEG6000處理兩葉一心期的晉棉19幼苗，獲得最佳NaCl處理濃度為200 mM，最佳PEG6000處理濃度為15％(w/v)。將目的基因片段構建到pTRV2載體上，得到了pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1、pTRV2-GhBBX1重組載體，將其轉入棉花。通過qRT-PCR和RT-PCR檢測目的基因沉

5、默情況，獲得目的基因表達量明顯下降的基因沉默植株。
　　2、對沉默植株進行鹽脅迫處理，檢測葉片凈光合速率，Pro含量，SOD活性，MDA含量，K+/Na+等5個耐鹽相關指標。結果表明:在鹽脅迫下，沉默GhZFP2、GhRCHY1、GhBBX1這三個基因的植株，葉片凈光合速率顯著低于Mock組，其中pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1達到了極顯著水平;所有沉默植株的Pro含量變化倍數均比Mock組低，其中pTRV2-

6、GhBBX1組達到了顯著水平;所有沉默植株的SOD活性變化倍數極顯著地低于Mock組;所有沉默植株的MDA含量變化倍數高于Mock組，但沒有達到顯著水平;所有沉默植株地上部分的K+/Na+顯著低于Mock組，其中 pTRV2-GhBBX1組達到了極顯著差異，pTRV2-GhRCHY1、pTRV2-GhBBX1組地下部K+/Na+顯著地低于Mock組。結果表明:在鹽脅迫下，基因沉默植株凈光合速率比Mock組低;滲透調節(jié)物質積累速率也比Mo

7、ck組低;清除活性氧的酶活變化比Mock組低，同時質膜氧化產物積累速率比Mock組高;地上部和地下部吸收和積累更多的Na+，使植株體內離子平衡受到破壞。
　　3、對沉默植株進行干旱脅迫處理，檢測葉片凈光合速率，葉片失水率，氣孔孔徑，Pro含量，SOD活性，MDA含量等6個耐旱相關指標。耐旱相關指標檢測結果表明:在干旱脅迫下，沉默GhZFP2、GhRCHY1、GhBBX1這三個基因的植株葉片凈光合速率低于Mock組，其中pTRV2-

8、GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1達到了顯著水平;所有沉默植株的葉片失水率都比Mock組高;干旱脅迫10d、20d后，所有沉默植株的氣孔孔徑都比Mock組小，且達到了極顯著差異;所有沉默植株的Pro含量變化倍數均比Mock組低，其中pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1組達到了顯著水平;所有沉默植株的SOD活性變化倍數顯著地低于Mock組;所有沉默植株的MDA含量變化倍數高于Mock組，其中pTRV2-GhBBX1組

9、達到了顯著差異。結果表明:在干旱脅迫下，基因沉默植株凈光合速率比Mock組低，影響植株的光合作用;葉片失水率比Mock組高同時氣孔孔徑比Mock組變小，植株水分散失較多;滲透調節(jié)物質積累速率也比Mock組低，滲透調節(jié)能力降低;清除活性氧的酶活變化比Mock組低，同時質膜氧化產物積累速率比Mock組高，破壞了質膜的完整性和穩(wěn)定性。
　　研究表明這三個基因都參與棉花對鹽脅迫和干旱脅迫的響應，目前這三個基因的轉基因棉花材料創(chuàng)制工作正在進