牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎冷凍保存研究.pdf

1、魚(yú)類胚胎冷凍保存對(duì)魚(yú)類種質(zhì)資源保護(hù)、低溫生物學(xué)、遺傳育種和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)都具有重要的意義。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，本文以牙鲆胚胎為材料，對(duì)玻璃化中所涉及到的主要影響因素：適宜胚胎發(fā)育階段的選擇、適宜抗凍劑的選擇、麥管的適宜長(zhǎng)度和盛裝抗凍劑體積等，以及顯微注射法中涉及到的抗凍劑毒性、抗凍劑注射劑量等影響胚胎冷凍保存的主要環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究。 結(jié)果表明：將囊胚期、原腸中期、胚孔封閉期、15-20

2、對(duì)肌節(jié)期、尾芽期、心跳期、出膜前期幾個(gè)時(shí)期的牙鲆胚胎分別浸泡在6M的PM(PG: MeOH=2:1 v/v)抗凍劑中，尾芽期胚胎的成活率最高，耐受能力最強(qiáng)，是較適宜進(jìn)行冷凍保存的胚胎階段。室溫下，PG、MeOH、DMSO、EG、DMF、GLY六種抗凍劑通過(guò)浸泡尾芽期胚胎而得出它們相對(duì)的毒性排列(由弱到強(qiáng))為PG

3、性相對(duì)排列不變。將毒性最小的PG，與MeOH、與DMSO分別混合浸泡胚胎，發(fā)現(xiàn)(兩種)混合后的抗凍劑所得到的胚胎成活率較單一抗凍劑有所提高，混合后的抗凍劑對(duì)胚胎毒性有所降低。將4M的PM分別與PVP、Dextran、Ficoll三種抗凍劑混合后，發(fā)現(xiàn)混有Fiocll的胚胎成活率最高，Dextran的最低，它們對(duì)胚胎的毒性相對(duì)排列為Ficoll

4、用三種規(guī)格的麥管5cm、7.5cm、10cm(長(zhǎng)度)分別進(jìn)行有卵和無(wú)卵的玻璃化冷凍實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5cm的麥管玻璃化效果最好，另外，麥管盛裝的玻璃化液體積為50ul時(shí)玻璃化效果最佳。 目前，魚(yú)類胚胎冷凍保存仍未達(dá)到應(yīng)用性水平，由于魚(yú)類胚胎體積大、卵膜通透性差等特點(diǎn)，傳統(tǒng)的平衡法，無(wú)法使抗凍劑足夠、有效的進(jìn)入胚胎內(nèi)部起到保護(hù)胚胎的作用。利用顯微注射技術(shù)，可直接將抗凍劑注射到魚(yú)類胚胎卵黃囊內(nèi)，一定程度上彌補(bǔ)了普通平衡法的不足，而且提高了抗

5、凍劑對(duì)胚胎的保護(hù)程度。本研究對(duì)顯微注射過(guò)程中的抗凍劑注射劑量、抗凍劑毒性等影響因素進(jìn)行了探索研究。發(fā)現(xiàn)：牙鲆胚胎較適宜的顯微注射劑量為750pl。DMSO、MeOH、PG、PVP、蔗糖幾種抗凍劑注射牙鲆胚胎后的毒性大小相對(duì)排列為DMSO>MeOH>PG，PVP>蔗糖，其中注射PG獲得的胚胎成活率和孵化率最高，注射PVP獲得的胚胎成活率和孵化率最低，而PG與MeOH組成混合抗凍劑PM毒性更低獲得的胚胎成活率和孵化率更高。而任何一種抗凍劑均

6、隨著濃度的增加其毒性隨之增加。在冷敏感實(shí)驗(yàn)中，顯微注射6M的PM的胚胎胚胎，應(yīng)用程序化法處理，以2℃/min的速率降至-20℃，平衡10min后解凍處理，發(fā)現(xiàn)注射PM的胚胎低溫處理后成活率為25.07±1.57％，而6M的PM五步平衡法同步處理的對(duì)照組胚胎成活率為20.88±2.84％，說(shuō)明顯微注射的胚胎冷敏感性有所降低。 在以上條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用玻璃化法、以及顯微注射法對(duì)牙鲆胚胎進(jìn)行了超低溫冷凍保存。在應(yīng)用玻璃化方法

7、對(duì)牙鲆胚胎超低溫冷凍保存中，共得到了7次尾芽期成活胚胎，1次心跳期成活胚胎，共獲得23粒復(fù)活胚胎，平均成活率為8.91％，其中14粒胚胎孵化出苗，孵化率為61.25％，有7尾正常魚(yú)苗，復(fù)活胚胎中成活時(shí)間最長(zhǎng)為84h。另外，應(yīng)用已篩選出的最優(yōu)條件，以35％PM和0.8％的PVP的不同體積配比，對(duì)大菱鲆心跳期胚胎進(jìn)行了嘗試性超低溫冷凍保存，冷凍存活1次，共8粒胚胎，成活率為21.05％(8/38)，其中有一粒孵化出膜。除此之外，在應(yīng)用顯微注