牙鲆胚胎冷凍保存的研究.pdf

1、魚類配子和胚胎的冷凍保存對魚類種質資源保護、低溫生物學、遺傳育種和水產養(yǎng)殖業(yè)都具有重要的意義。胚胎的冷凍保存是一項系統(tǒng)工作，一個環(huán)節(jié)處理不慎，都會導致整個保存實驗的失敗。本研究以牙鲆(paralichthys olivaceus)胚胎為材料，對影響魚類胚胎冷凍保存的主要環(huán)節(jié)分別進行了探討，并在此基礎上進行了超低溫程序化和玻璃化冷凍保存研究。本研究主要從以下幾個方面對海水魚類胚胎的冷凍保存進行了探討： 1.低毒高效的抗凍液是胚胎冷

2、凍保存成功的基礎。通過魚類胚胎在抗凍液中處理一定時間的成活率高低來篩選改進合適的抗凍劑。本實驗改良了程序化冷凍抗凍劑，首先篩選了PM比例，發(fā)現P:M=2:1時處理的胚胎成活率顯著高于其他比例(p<0.05)。然后對PM在抗凍劑中的百分比進行了篩選，其中經過23％PM21處理過的牙鲆尾芽期胚胎成活率高于其他。通過在23％PM2l添加1％PVP(m/m)， 2％PVP(m/m)、DMF(0.1mol/L)、DMSO(0.1mol/L)，得出

3、0.1mol/L DMF較其它能提高胚胎成活率。但差異不顯著(P>0.05)。 2.最佳冷凍程序也是程序化冷凍保存成功的關鍵。實驗中，我們對降溫速率、植冰溫度做了系統(tǒng)化研究，發(fā)現由室溫開始，以2℃/rain的速率降至-12℃，然后植冰，能夠對胚胎提供最佳保護。實驗最后在此程序下采用23％PMDMF對牙鲆尾芽期胚胎進行程序化冷凍，共凍存12管，共36粒胚胎，保存5hr后解凍復溫，洗脫后得到3粒成活胚胎，成活率為8.33％，無畸形。

4、16℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至孵化出膜后全部死亡。 3.玻璃化液的篩選是玻璃化冷凍保存法的重要環(huán)節(jié)。本實驗在前面的基礎上，篩選了添加1％PVP的35％PM21，并采用1/3(3.3cm)的麥管(以規(guī)格10cm×2.3mm的麥管為準)，成功的對牙鲆尾芽期胚胎進行超低溫冷凍保存，解凍后得到成活胚胎1粒，畸形。孵化至出膜后死亡。 4.本研究通過顯微注射技術將抗凍劑直接注射到牙鲆胚胎中，來實現牙鲆胚胎的玻璃化低溫冷凍保存。在此研究中，