牙鲆(Paralichthys olivaceus)性另相關(guān)基因dax1的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、性別決定和性腺分化是魚類生殖過程的重要部分，也是保證其生存和進(jìn)化的一個基本過程。dax1基因是孤兒核受體的一員，在性別決定和分化中有著重要的作用。本研究首先克隆了鲆鰈魚-牙鲆(Paralichthys olivaceus)dax1全長cDNA及5’側(cè)翼區(qū)序列，研究了該基因在成魚各組織的特異表達(dá)，進(jìn)一步采用實(shí)時定量PCR技術(shù)分析了該基因在早期胚胎發(fā)育以及性腺分化發(fā)育過程中的表達(dá)，并研究了該基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)。同時在體外對該基

2、因進(jìn)行了原核重組表達(dá)。
　　 首先，本研究采用RT-PCR以及RACE等方法從牙鲆性腺組織中克隆出牙鲆dax1基因的全長cDNA序列(Genebank accession No.HQ380020)。分析結(jié)果表明，牙鲆dax1 cDNA序列全長1446bp，包括5’非翻譯區(qū)219bp，3’非翻譯區(qū)330bp，開放閱讀框897 bp，編碼298個氨基酸殘基，理論蛋白分子量為33.08 kDa。該cDNA序列具有脊椎動物典型的加尾信號

3、AATAAA和Poly(A)。牙鲆Dax1的DNA結(jié)合域DBD缺乏典型的鋅指結(jié)構(gòu)，與其他非哺乳類動物Dax1蛋白類似，牙鲆Dax1只有一個保守的LXXLL基序，而沒有NR盒1和NR盒2。序列相似性比對發(fā)現(xiàn)，牙鲆dax1與其他魚類dax1相似性最高，繼而是鳥類、爬行類和哺乳類。
　　 利用基因組步移的方法，獲得了牙鲆dax1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前2Kb的基因組序列，并識別出可能的啟動子序列。用MatInspector等軟件對牙鲆dax15

4、’側(cè)翼序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)一步對牙鲆和其他脊椎動物的dax15’側(cè)翼序列的保守功能模塊和網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，牙鲆dax15’側(cè)翼區(qū)存在sf1、wt1、TCF/LEF、oct3/4等保守的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示，dax1基因在牙鲆成體大多數(shù)組織中都可以檢測到，性腺、脾臟和腦表達(dá)量相對較高，而肝臟和肌肉的表達(dá)量相對較低。在兩性性腺中均可以檢測到該基因的表達(dá)，但是存在比較明顯的兩性表達(dá)差異

5、，在卵巢中的表達(dá)強(qiáng)于精巢。Real-time PCR結(jié)果顯示，該基因在牙鲆胚胎發(fā)育早期就可以檢測到表達(dá)，但各發(fā)育階段表達(dá)量不同。該基因在二倍體對照牙鲆、雌核發(fā)育及雌核發(fā)育性反轉(zhuǎn)牙鲆性腺分化開始前(全長約2cm)表達(dá)量迅速升高，達(dá)到最大值，在性腺分化開始時表達(dá)最降低。同時，該基因在不同性腺發(fā)育時期的表達(dá)量也有差異。整體來說，dax1在牙鲆各期卵巢中的表達(dá)量都高于相應(yīng)時期精巢中的表達(dá)量。其中，Ⅰ期雌雄性腺中表達(dá)量相近，Ⅱ期精巢和卵巢中表達(dá)量

6、都有所上升，之后在Ⅲ期在精巢和卵巢都有所下降，但卵巢表達(dá)量依舊略高于精巢，到Ⅳ期表達(dá)再次上升，尤其是卵巢的表達(dá)量上升較明顯，Ⅴ期表達(dá)量比Ⅳ期略有下降。
　　 甲基化表觀遺傳修飾水平研究結(jié)果顯示，牙鲆dax1基因調(diào)控區(qū)的14個CpG位點(diǎn)的甲基化水平均較低，不存在明顯的兩性差異。卵巢中的甲基化水平為1.4％(2/140)，精巢中的甲基化水平為2.1％(3/140)。雌核發(fā)育牙鲆卵巢及雌核發(fā)育性反轉(zhuǎn)牙鲆的精巢dax1基因調(diào)控區(qū)CpG位

7、點(diǎn)甲基化水平也沒有明顯的兩性差異，前者2.1％(3/140)的CpG位點(diǎn)發(fā)生了甲基化，后者中也僅有2.8％(4/140)的CpG位點(diǎn)發(fā)生了甲基化，。
　　 將牙鲆dax1基因編碼區(qū)序列插入到表達(dá)質(zhì)粒pProEXTMHTa上，在大腸桿菌Transetta(DE3)中對Dax1蛋白進(jìn)行體外重組表達(dá)原核表達(dá)。獲得的重組蛋白存在于宿主菌中，不是分泌型蛋白，大部分的Dax1重組蛋白以包涵體形式出現(xiàn)。在37℃的培養(yǎng)條件下，重組蛋白的最佳IP