甜菜夜蛾核多角體病毒在Se301細(xì)胞中的持續(xù)感染研究.pdf

1、桿狀病毒是一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，可特異性地感染包括許多重要農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)害蟲(chóng)在內(nèi)的節(jié)肢動(dòng)物。桿狀病毒持續(xù)感染在野外昆蟲(chóng)宿主種群中普遍存在。在某些條件刺激下，持續(xù)感染可轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋承愿腥?，并引發(fā)流行病。因此，桿狀病毒持續(xù)感染對(duì)昆蟲(chóng)種群動(dòng)力學(xué)以及病毒流行病學(xué)的研究具有重要意義。但是，目前仍未建立一個(gè)較好的病毒-宿主模型來(lái)研究桿狀病毒持續(xù)感染的機(jī)制。本論文以甜菜夜蛾核多角體病毒(SeMNPV)及其宿主細(xì)胞Se301作為研究對(duì)象，首次建立了SeMNP

2、V持續(xù)感染的Se301細(xì)胞系，并從中克隆了一株不產(chǎn)生可感染性病毒但可抑制SeMNPV感染的細(xì)胞株，為研究桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中持續(xù)感染的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 雖然SeMNPV感染Se301細(xì)胞最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡，但當(dāng)SeMNPV在Se301細(xì)胞中無(wú)稀釋連續(xù)傳代時(shí)，其子代病毒感染性逐漸降低。本研究中，在Se301細(xì)胞中無(wú)稀釋傳至第8代的SeMNPV感染Se301細(xì)胞后，少量細(xì)胞能夠存活，并保持增殖能力。我們將該細(xì)胞系命名為P

3、8-Se301。P8-Se301細(xì)胞群體生長(zhǎng)速度慢于Se301細(xì)胞，4.14±0.99％的細(xì)胞可持續(xù)釋放可感染性的芽生型病毒，部分細(xì)胞中可見(jiàn)多角體和病毒發(fā)生基質(zhì)等病毒感染特征。SeMNPV感染P8-Se301細(xì)胞，細(xì)胞的病理現(xiàn)象沒(méi)有明顯增加；芽生型病毒和多角體總數(shù)的產(chǎn)量與未感染P8-Se301細(xì)胞的類似。P8-Se301細(xì)胞釋放的子代病毒vP8-Se301與SeMNPV共同感染Se301細(xì)胞后，其病毒滴度較野生型SeMNPV感染細(xì)胞所產(chǎn)

4、生的滴度低，表明vP8-Se301對(duì)SeMNPV具有干擾作用。Dot blot分析表明，提取的P8-Se301總DNA中的0.21％為SeMNPV的基因組成分。Southern blot和PCR分析表明，雖然P8-Se301細(xì)胞的胞內(nèi)病毒基因組包含了大部分SeMNPV基因組片段，但仍缺失了部分SeMNPV基因組片段。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定表明，在每個(gè)P8-Se301細(xì)胞中平均含有(4.40±2.14)×103個(gè)SeMNPV多角體蛋白基因

5、(polh)拷貝。RT-PCR可檢測(cè)到P8-Se301細(xì)胞中SeMNPV極早期基因ie-0、早期基因dnapol、晚期基因orf67和極晚期基因polh的轉(zhuǎn)錄本。以上結(jié)果證實(shí)了P8-Se301細(xì)胞是一株SeMNPV持續(xù)感染的細(xì)胞。
　　 利用單細(xì)胞克隆方法，從P8-Se301細(xì)胞中得到一株細(xì)胞克隆，命名為P8-Se301-C1。P8-Se301-C1細(xì)胞形態(tài)與Se301細(xì)胞相似，細(xì)胞中未見(jiàn)多角體和病毒發(fā)生基質(zhì)等病毒感染特征。但與

6、P8-Se301一樣，其細(xì)胞群體生長(zhǎng)速度較Se301細(xì)胞的慢。TCID50終點(diǎn)稀釋法和感染中心測(cè)定表明，P8-Se301-C1細(xì)胞不產(chǎn)生可感染性病毒。SeMNPV感染P8-Se301-C1細(xì)胞的子代病毒產(chǎn)量較其感染Se301的顯著下降，表明P8-Se301-C1細(xì)胞具有抑制SeMNPV復(fù)制的能力。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，在SeMNPV感染細(xì)胞1h內(nèi)，進(jìn)入P8-Se301-C1細(xì)胞和Se301細(xì)胞中的病毒數(shù)量無(wú)顯著性差異；但Dot b

7、lot分析表明，在SeMNPV感染6h時(shí)或之前，其DNA復(fù)制在P8-Se301-C1細(xì)胞中受到抑制，證明P8-Se301-C1細(xì)胞對(duì)SeMNPV感染的干擾作用是發(fā)生在病毒進(jìn)入細(xì)胞后，DNA復(fù)制時(shí)或復(fù)制前的早期感染階段。以提取的P8-Se301-C1細(xì)胞的總DNA為模板，PCR可擴(kuò)增得到SeMNPV ie-0和polh基因片段，但不能得到dnapol和orf67基因片段，表明P8-Se301-C1細(xì)胞中含有不完整的SeMNPV基因組。Do

8、t blot分析表明，1.25×105個(gè)P8-Se301-C1細(xì)胞中含有0.32±0.16 ng SeMNPV DNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，單個(gè)P8-Se301-C1細(xì)胞中SeMNPV polh基因的拷貝數(shù)為13.24±4.27。巢式RT-PCR可檢測(cè)到P8-Se301-Cl1細(xì)胞中的SeMNPV polh基因轉(zhuǎn)錄本。以上結(jié)果表明P8-Se301-C1含有少量不完整的SeMNPV基因組，但不產(chǎn)生子代病毒，說(shuō)明該細(xì)胞可能存在SeMNP