苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒e25的功能研究.pdf

1、桿狀病毒是一類特異性感染節(jié)肢動物的DNA病毒。在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中會產(chǎn)生兩種子代病毒體：芽殖型病毒體(budded virus，BV)和包涵體源性病毒體(occlusion derived virus，ODV)。病毒基因的表達(dá)具有時序性，依照轉(zhuǎn)錄時間的先后分為：早期，晚期和極晚期。目前發(fā)現(xiàn)有33個基因存在于所有57種已經(jīng)測序的桿狀病毒基因組中，稱為核心基因。e25(原名odv-e25)是一個晚期基因，且為核心基因之一，其編碼產(chǎn)物存

2、在于BV和ODV包膜，但在病毒復(fù)制中的功能尚未明了。
　　 本文以苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV)e25為研究對象，研究了該基因在病毒復(fù)制中的功能。主要研究結(jié)果包括以下內(nèi)容：
　　 1.利用λ-Red同源重組技術(shù)，用氯霉素抗性基因(cat)替代AcMNPV BacmidbMON14272中orf94(e25)

3、的第2個堿基開始的591bp序列，構(gòu)建了e25敲除型bacmid vAce25ko。
　　 2.利用Bac-to-Bac系統(tǒng)，將AcMNPV多角體蛋白基因(polh)和與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(egfp)分別插入vAce25ko和bMON14272的polh位點(diǎn)構(gòu)成帶有polh和egfp標(biāo)記的e25敲除突變體vAce25ko-PH-gfP和野生型bacmid vAcPH-gfP；以同樣方法將e25連同polh和egfp標(biāo)記基因插

4、入vAce25kopolh位點(diǎn)構(gòu)成e25敲除異位回復(fù)突變體vAce25ko-rep-PH-gfp。通過轉(zhuǎn)染-感染實驗和病毒增殖曲線的繪制，證實e25是病毒增殖的必需基因，敲除e25導(dǎo)致影響病毒體BV不能產(chǎn)生，但不影響多角體的形成。
　　 3.利用AcMNPV早期基因iel和晚期基因p10啟動子控制e25的表達(dá)，構(gòu)建了e25早表達(dá)回復(fù)突變體和e25過量表達(dá)回復(fù)突變體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，e25早表達(dá)會影響病毒BV的產(chǎn)生，不影響多角體的形成；

5、晚期過量表達(dá)不影響病毒的增殖。
　　 4.通過由早期基因dnapol和晚期基因vp39啟動子控制報告基因gus的表達(dá)來檢測e25敲除和早表達(dá)對病毒早期基因和晚期基因表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)相比于e25正?；貜?fù)組，在轉(zhuǎn)染后48h內(nèi)，e25敲除和早表達(dá)對早期基因dnapol啟動子控制的gus表達(dá)水平均沒有明顯影響；e25敲除對晚期基因vp39啟動子控制的gus表達(dá)也無明顯影響；但早表達(dá)對vp39啟動的gus表達(dá)水平在36hpt和48hpt分

6、別下降64％和63％。表明e25早表達(dá)可能導(dǎo)致vp39和其它晚期基因表達(dá)水平下調(diào)。
　　 5.核內(nèi)肌動蛋白(F-actin)的聚合對病毒的增殖是必需的，E25和F-actin都有定位于病毒發(fā)生基質(zhì)。通過羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色觀察被轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白的分布發(fā)現(xiàn)，e25敲除、早表達(dá)和正常表達(dá)情況下，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞核內(nèi)都能觀察到紅色的羅丹明熒光，說明e25敲除和早表達(dá)對由病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞核內(nèi)肌動蛋白的聚合無明顯影響。
　　 6.在

7、轉(zhuǎn)染后不同時間點(diǎn)觀察E25的定位發(fā)現(xiàn)，24hpt E25蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，36hpt分布于核外周，細(xì)胞質(zhì)中少量分布，轉(zhuǎn)染后48h和72h，E25蛋白主要集中在細(xì)胞核內(nèi)。說明E25在受轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的定位由核外向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　 7.將egfp編碼序列插入至e25第1、45、118和227位密碼子之后或替代2-45aa、46-117aa或118-227aa編碼序列，構(gòu)建了7個e25基因突變體；再將這些基因突變體分別插入vAce2

8、5ko或bMON14272構(gòu)建了14個突變體重組病毒。轉(zhuǎn)染-感染實驗發(fā)現(xiàn)，只有包含正常e25和egfp替代2-45aa的e25突變體的病毒能夠大量增殖；包含正常e25和egfp替代46-117aa或插入第227位密碼子之后的e25突變體的病毒有少量增殖；包含egfp插入第227位密碼子之后的e25但不含正常e25的病毒也有少量增殖；含正常e25和egfp插入第1位密碼子之后的e25或只含egfp插入第1位密碼子之后的e25突變體的病毒完

9、全沒有子代病毒產(chǎn)生；其它病毒突變體感染的細(xì)胞中只有個別細(xì)胞出現(xiàn)病毒增殖跡象。這些結(jié)果表明，上述所有插入或替代突變都導(dǎo)致病毒完全不復(fù)制或增殖量顯著下調(diào)；而且突變體E25抑制正常E25的功能。
　　 8.免疫熒光實驗和共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在沒有正常e25存在的情況下，2-45aa被替代或在第2位密碼子前插入egfp導(dǎo)致E25不能入核；在第227位密碼子后插入egfp對E25入核幾乎沒有影響；其它插入或替代突變都不同程度地抑制E25