甜菜夜蛾海藻糖酶和幾丁質(zhì)酶在昆蟲細胞中的表達.pdf

1、幾丁質(zhì)是昆蟲生長和發(fā)育的關鍵物質(zhì)。海藻糖酶與幾丁質(zhì)酶是昆蟲幾丁質(zhì)合成與降解過程中的兩種重要的酶。海藻糖酶(Trehalase，EC3.2.1.28)能夠?qū)Ｒ恍缘卮呋夂Ｔ逄?。昆蟲海藻糖酶通常分為兩種，可溶性海藻糖——海藻糖酶1(Tre-1)與膜結(jié)合型海藻糖酶——海藻糖酶2(Tre-2)。幾丁質(zhì)酶(Chitinase，EC3.2.1.14)屬于水解酶第18家族，能夠特異性地水解多聚幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)酶是一個多基因家族，昆蟲體內(nèi)常有多種幾丁質(zhì)

2、酶和類幾丁質(zhì)酶蛋白，其中細菌型幾丁質(zhì)酶(Chi-h)在幾丁質(zhì)降解的過程中同時具備內(nèi)切和外切幾丁質(zhì)酶活性。
　　 為了重組表達獲得有活性的海藻糖酶和幾丁質(zhì)酶，基于我們實驗室已有的甜菜夜蛾Spodoptera exigua可溶性海藻糖酶SeTre-1、膜結(jié)合型海藻糖酶SeTre-2及細菌型幾丁質(zhì)酶SeChi-h基因，本文首先利用Bac-to-Bac昆蟲細胞表達系統(tǒng)，成功構建轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-Tre-1、pFastBac1-

3、Tre-2與pFastBac1-Chi-h，在DH10Bac中將重組轉(zhuǎn)移載體中的目的基因轉(zhuǎn)座到Bacmid桿粒中，并在sf9細胞內(nèi)擴增獲得高滴度的重組桿狀病毒P-Tre-1、P-Tre-2與P-Chi-h。然后利用重組桿狀病毒感染Hi5細胞，經(jīng)過SDS-PAGE及Western印跡分析和酶活測定，證明獲得有海藻糖水解活性的重組海藻糖酶rSeTre-1與rSeTre-2，以及具有幾丁質(zhì)水解活性的重組幾丁質(zhì)酶rSeChi-h。利用Ni-NT

4、A技術獲得了純化的rSeTre-1與rSeChi-h，其中rSeTre-1的酶活力為264.3U/1 mg protein，表達量為25 mg/1 Lmedium；rSeChi-h的酶活力為2.22U/1 mg protein，表達量為32 mg/1 L medium。去糖基化實驗還表明rSeTre-1有較高程度的N-糖基化，N-糖基相對含量為約10％。
　　 此外，本研究還分析了重組海藻糖酶rSeTre-1的酶學特性，發(fā)現(xiàn)rS