煙草核基質(zhì)結(jié)合序列在轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性中的功能及機理分析.pdf

1、目前通過植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行作物品種的改良已經(jīng)成為作物品質(zhì)改良的重要手段。我們都希望外源轉(zhuǎn)入的優(yōu)良基因能在作物中得到高效和穩(wěn)定的表達，但是外源的基因在轉(zhuǎn)入植物中一代或者幾代后會出現(xiàn)不再表達、表達變?nèi)醯默F(xiàn)象。這種現(xiàn)象的發(fā)生很大程度上是由于轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象導(dǎo)致的。由于轉(zhuǎn)基因沉默嚴重阻礙轉(zhuǎn)基因商品化的進程，因此，如何提高轉(zhuǎn)基因后代的遺傳穩(wěn)定性、減少轉(zhuǎn)基因沉默的發(fā)生是一個亟待解決的問題。 核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(Matrix Attachment R

2、egions，MARs)是基因組上通常富含A/T的能夠?qū)NA或染色質(zhì)附著到核基質(zhì)上的DNA序列。通過與結(jié)合蛋白的互作，MARs在維持或修飾DNA或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及調(diào)控相關(guān)基因方面表達中發(fā)揮重要作用。以往的研究者發(fā)現(xiàn)核基質(zhì)結(jié)合序列在減少轉(zhuǎn)基因沉默方面具有重要作用。 TM6是本實驗室從煙草核基質(zhì)中分離得到的一個具有一般MARs結(jié)構(gòu)特征的DNA序列，核基質(zhì)體外結(jié)合實驗證明TM6與煙草核基質(zhì)具有很強的體外結(jié)合能力。為了研究TM6在植物體內(nèi)

3、的功能，主要是在其提高轉(zhuǎn)基因后代遺傳穩(wěn)定性中的作用，我們構(gòu)建不同的植物表達載體并轉(zhuǎn)化了雙子葉植物煙草和擬南芥，對轉(zhuǎn)基因植株中TM6連接的外源基因的表達情況進行了分析。為了進一步研究TM6的作用機理，本實驗還分析了TM6對其鄰近啟動子區(qū)域DNA甲基化的影響，主要實驗結(jié)果如下： 1.在雙子葉植物煙草中，雙TM6能夠明顯的降低雜交后代的轉(zhuǎn)基因沉默比例，提高轉(zhuǎn)基因后代的遺傳穩(wěn)定性。這個實驗結(jié)果為TM6在提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳穩(wěn)

4、定性方面的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。 2.煙草TM6序列能夠顯著提高側(cè)翼啟動子區(qū)對核酸酶的敏感性。在DNaseI處理后的轉(zhuǎn)TM6的轉(zhuǎn)基因煙草細胞核內(nèi)，TM6顯著降低了CaMV35S啟動子區(qū)域的特異擴增水平，初步說明TM6能夠減低其鄰近啟動子區(qū)域DNA甲基化水平，從而降低基因沉默的發(fā)生，提高基因表達。 3.對轉(zhuǎn)基因煙草中CaMV35S和NOS啟動子區(qū)域的DNA甲基化程度進行檢測，分析得知：在CaMV35S啟動子區(qū)域，沒有TM6的

5、轉(zhuǎn)基因煙草植株的DNA甲基化水平較高大約在13％～37％，而有TM6的轉(zhuǎn)基因煙草植株中幾乎沒有DNA甲基化的發(fā)生；在NOS啟動子區(qū)域，沒有TM6的轉(zhuǎn)基因煙草植株的DNA甲基化水平較高大約在24％～51％，而有TM6的轉(zhuǎn)基因煙草植株的DNA甲基化水平在9％～14％左右。該實驗進一步驗證了TM6能夠顯著降低其鄰近啟動子區(qū)域DNA甲基化水平。 4.雙子葉植物煙草中分離的TM6同樣可以在擬南芥中增強外源基因的表達，并且在不同類型的啟動子