IGF-I轉(zhuǎn)基因羊基因穩(wěn)定性分析.pdf

1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在，經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展過程，特別是近十年來，更是有了突飛猛進的發(fā)展。研究人員對轉(zhuǎn)基因動物的要求已經(jīng)從最初的獲得轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)化成為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類優(yōu)質(zhì)生活服務(wù)的目標(biāo)上來。
　　目的：本實驗研究對象為類胰島素樣生長因子 I（IGF-I）轉(zhuǎn)基因細毛羊及其后代，以導(dǎo)入到宿主體內(nèi)的外源基因 IGF-I為研究目標(biāo)，通過對 IGF-I轉(zhuǎn)基因細毛羊外源基因的整合位點、拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進行研究，旨在為外源基因的功能研究

2、奠定基礎(chǔ)，為轉(zhuǎn)基因細毛羊的高效生產(chǎn)提供借鑒。
　　方法：試驗一：對本實驗室構(gòu)建的 IGF-I轉(zhuǎn)基因細毛羊及其后代進行陽性個體鑒定。根據(jù)外源基因質(zhì)粒序列設(shè)計特異性引物，采用 PCR法對本實驗室構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細毛羊進行陽性個體鑒定。試驗二：利用實時熒光定量 PCR技術(shù)，設(shè)計實時熒光定量 PCR引物，對鑒定結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因細毛羊外源基因拷貝數(shù)進行檢測。試驗三：通過相對實時熒光定量 PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因細毛羊皮膚組織 IGF-I mRNA表

3、達水平進行分析。試驗四：利用 Western免疫印跡法，通過對外源基因在轉(zhuǎn)基因細毛羊皮膚組織及內(nèi)臟蛋白的表達定量分析，對外源基因翻譯水平進行檢測。試驗五：采用染色體步移技術(shù)，提取轉(zhuǎn)基因細毛羊基因組 DNA，對外源基因在 IGF-I轉(zhuǎn)基因細毛羊基因組 DNA上的整合位點進行分析。
　　結(jié)果：試驗一：結(jié)果表明：轉(zhuǎn) IGF-I基因細毛羊0152、0016、118、0217四只細毛羊均為 IGF-I轉(zhuǎn)基因細毛羊。試驗二：結(jié)果表明：IGF-

4、I轉(zhuǎn)基因細毛羊0152、0016、118、0217外源基因的拷貝數(shù)分別為3、1、1、1。實驗三：結(jié)果表明：IGF-I基因在皮膚組織中的相對表達量在 IGF-I轉(zhuǎn)基因細毛羊0152、0016、118、0217分別為對照組細毛羊相對表達量的2.87倍、2.03倍、1.86倍和1.85倍，差異均極顯著（P<0.01）。轉(zhuǎn)基因原代羊0016皮膚組織中 IGF-I基因的表達量分別是一代羊118和0217的178.9％倍和150%，差異極顯著（P<

5、0.01）；轉(zhuǎn)基因原代羊0152 IGF-I基因在皮膚組織中的相對表達量分別是其后代118和0217的207%和174%，差異極顯著（P<0.01）。原代羊0152與0016皮膚組織中 IGF-I基因的相對表達量差異不顯著（P>0.05）；一代羊118和0217皮膚組織中的 IGF-I基因相對表達量差異不顯著（P>0.05）。實驗四：結(jié)果表明：IGF-I蛋白在 IGF-I轉(zhuǎn)基因細毛羊0152、0016、118、0217皮膚組織的相對表達

6、量分別為1.55、1.08、0.55、0.62，其表達量分別為相同年齡普通細毛羊的213%、187%、129%、127%，差異均極顯著（P<0.01）。IGF-I轉(zhuǎn)基因細毛羊0152內(nèi)臟器官 IGF-I蛋白表達與普通細毛羊比較結(jié)果顯示：IGF-I蛋白在轉(zhuǎn)基因細毛羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和皮膚的相對表達量分別為0.348、2.571、0.863、0.731、0.316、0.124、0.481，普通細毛羊 IGF-I蛋白相對表達

7、量在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和皮膚相對表達量分別為0.357、2.564、0.847、0.727、0.304、0.127、0.215，除在皮膚組織 IGF-I蛋白相對表達量 IGF-I轉(zhuǎn)基因細毛羊0152為普通細毛羊223.8%，差異極顯著（P<0.01），其余組織器官IGF-I蛋白的相對表達量在轉(zhuǎn)基因細毛羊0152和普通細毛羊之間差異不顯著（P>0.05）。實驗五：結(jié)果表明：外源基因插入位點在 IGF-I轉(zhuǎn)基因細毛羊0152