單子葉石蒜科植物黃花石蒜甘露糖結合凝集素基因的克隆及序列分析風雨花凝集素基因轉化煙草及其在轉基因煙草中的表達

1、第一部分單子葉石蒜科植物黃花石蒜甘露糖結合凝集素基因的克隆及序列分析生物化學與分子生物學專業(yè)研究生：常麗青指導教師：鮑錦庫摘要：黃花石蒜凝集素(卻∞mchinensisAgglutinin，LCA)是來源于石蒜科的具有多重生物學活性的甘露糖結合蛋白，屬于單子葉甘露糖結合凝集索。這類凝集素由于具有獨特的糖結合特異性、逆轉錄病毒抑制活性和保護農(nóng)作物免受昆蟲和線蟲攻擊而引起人們濃厚的興趣。本文采用同源克隆的方法，通過對黃花石蒜球莖RNA的提取

2、，反轉錄成cDNA，從Genbank上比較已登錄的石蒜科凝集素的序列，找出其保守序列，并結合軟件設計了簡并引物，進行3’RACE末端快速擴增，得到了3’端的部分序列(序列號為AY690318)，序列長為516bp，然后根據(jù)已得到的序列設計特異性引物，應用在eDNA的37端隨機添加若干PolvA的方法，在eDNA模板3’端加上PolyA，再以此為模板進行PCR，從而克隆得到了黃花石蒜5’端的部分序列(序列號為AY763111)，序列長為4

3、1lbp，將37與5’序列合并，就能獲得cDNA全長序列(序列號為AY763112)。以獲得的全長cDNA序列和推導出的氨基酸序列與石蒜科其他植物凝集素在Genbank中的Blast上進行比較，可知黃花石蒜的全長cDNA序列由683個核苷酸組成，開放閱讀框長486bp，編碼162個氨基酸，起始密碼子位于第3739bp，終止密碼子位于在523—525bp處，在起始密碼子上游有一個由36個堿基組成的5’非編碼區(qū)；在終止密碼予下游有一個由14

4、1個堿基組成的3’非編碼區(qū)，包括兩個加poly(A)信號和一段真核生物rnRNA所特有的polkA)序列。通過序列的測定，發(fā)現(xiàn)LCA基因均編碼前體蛋自：含有信號肽序列、成熟蛋白序列和C一末端剪切序列。該成熟蛋白由109個氨基酸組成，分子量為121KD。MolecularCloningandAnalyzingofAgglutininfromLycorischinensisMajor：Biochemistryandmolecularbiol

5、ogyGraduate：ChangLi—QingTutor：BaoJinKuAbstract：LycorischinensisAgglutinin(LCA)fromAmaryllidaceaespeciesisamannose—bindingproteinwithvariousbiologicalactivitiesItbelongstothemonocotmaimose—bindinglectin(MBL)Thelectinshave

6、receivedalotofattentionindifferentscientificdisci[Ilinesbecauseoftheiruniqueandexclusivespecificitytowardsmannose，theirretrovirusinhibitoryactivityandtoxicitytoinsectsThetotalRNAofLy’corischinensiswasextractedandthenreve

7、rsetranscriptintoeDNAAprimerWaSdesignedbasedontheconservedlegionsofother～BLplant’SaggIntininthroti曲homologyalignmentUsingtheRTPCR，3’RACE(rapidamplificationofeDNAends)technique，aDNAfragmentswasfirstclonedfromLycorischinen

8、sisbyperformingPCRthatusedLycorischinensiseDNAgenomeasthetemplateIthas516nucleotides(accessionnumberinGenbank：AY690318)Thenanothertwoprimersweredesignedaccordingt0thesequenceof3’endsODewasusedteversetranscripttheRNAintoe

9、DNA，polyAwereaddedtothe3’endsofeDNAwiththefunctionofTdT(TerminalDeoxynucleotidylTransferase)，usingthe5’RACEtechniquethefragmentof411nucleotideswascloned(accessionnumberinGenBank：AY763111)ThetwopartiallyoverlappingeDNAfra

10、gmentswereassembledafull—lengtheDNAsequenceofLycorischinensis(accessionnumberinGenbank：AY763112)Thefull—lengthcDNAhad683bp，andthesequenceencodedanopenreadingframeof162aminoacidsThestartcodonwasat3739b口andthestopcodonwas3