大GTP酶Dynamin2在卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中的調控作用.pdf

1、哺乳動物卵母細胞的成熟需要經(jīng)過兩次不均等的減數(shù)分裂。第一次減數(shù)分裂和第二次減數(shù)分裂都需要保證卵母細胞中染色體的精準分離，從而確保形成的大的卵母細胞有足夠的維持后代發(fā)育的遺傳物質。卵母細胞中微絲和微管能夠直接調控卵母細胞的極化過程，排出極體。在卵母細胞成熟過程中，微絲是關鍵的動力因素，其能夠形成微絲流，推動紡錘體遷移到細胞皮質層，進而促使卵母細胞排出極體。
　　哺乳動物胚胎著床前的發(fā)育主要是從合子發(fā)育到囊胚期，是一個十分復雜的過程主

2、要包括細胞分裂、細胞分化以及細胞形態(tài)的改變。受精后，合子在母源性機制調控下開始卵裂，合子的基因組被激活。當胚胎發(fā)育到8細胞時發(fā)生致密化，且卵裂球發(fā)生極化。隨著繼續(xù)卵裂，胚胎分化成兩種類型的細胞:內細胞團和滋養(yǎng)層細胞。內細胞團將來發(fā)育成胎兒的各種組織，滋養(yǎng)層細胞將來發(fā)育成胎膜和胎盤。
　　微絲是細胞骨架和肌動蛋白的重要組成部分，其對于細胞生長、遷移、增殖等十分重要。目前的研究發(fā)現(xiàn)，調控肌動蛋白的因子是通過G蛋白偶聯(lián)受體、酪氨酸激酶受

3、體及其他特殊的受體發(fā)揮作用的。這些受體能夠激活一系列信號通路，包括小GTP酶家族的Rho家族(Rho，Rac，Cdc42)及其效應因子，鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)，其下游的蛋白激酶效應器(包括Rho激酶/ROCK以及PAK)以及能夠直接結合GTP酶的幾種蛋白（皮動蛋白，WAVE和WASP等）。
　　大GTP酶Dynamin在網(wǎng)格蛋白介導的細胞內吞、膜泡運輸?shù)冗^程中發(fā)揮重要作用，而Dynamin2亞基被發(fā)現(xiàn)在細胞膜重構的位置與

4、微絲共定位，揭示了大GTP酶參與并調控了細胞骨架的形成。但作為細胞內重要的發(fā)動蛋白，其對卵母細胞減數(shù)分裂及早期胚胎發(fā)育的調控作用仍不清楚，因此有必要探索大GTP酶Dynamin在卵母細胞成熟及早期胚胎發(fā)育過程中的具體作用機制進行探索，這對于提高家畜繁殖力乃至治療人類不孕疾病有十分重要的意義。
　　本論文選取ICR小鼠卵母細胞為研究對象，采用抑制劑處理、顯微注射等技術手段阻斷、干擾Dynamin的翻譯，并通過免疫熒光染色、活細胞工作

5、站觀測、激光共聚焦顯微鏡觀察等方法研究其對于哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂及早期胚胎發(fā)育的影響、探索其發(fā)揮作用的信號通路。研究內容主要包括以下幾個方面:試驗一,(1)通過免疫熒光染色法確定Dynamin在卵母細胞中的定位;(2)用抑制劑處理或者注射干擾RNA后，統(tǒng)計卵母細胞成熟率;(3)通過免疫熒光染色及活細胞工作站觀測，探索Dynamin的表達被抑制后，微絲、微管、紡錘體遷移的動態(tài)變化;(4)通過免疫熒光染色的方法，檢測下游蛋白的表達水平;

6、試驗二，(1)通過免疫熒光染色確定Dynamin在早期胚胎發(fā)育過程中的定位;(2)用抑制劑處理早期胚胎，統(tǒng)計其卵裂比例及囊胚形成的比例;(3)通過熒光染色檢測肌動蛋白的表達水平。
　　本研究分為2個部分，通過本研究可得出以下結論:
　　試驗一、大GTP酶Dynamin2調控小鼠卵母細胞發(fā)育過程中微絲介導的紡錘體遷移細胞骨架在卵母細胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明Dynamin能夠調控基于微絲的膜泡運輸，其中Dyna

7、min2亞基被發(fā)現(xiàn)可與微管結合調控細胞周期及中心體的凝聚。然而，關于Dynamin對于卵母細胞成熟過程中發(fā)揮的作用并不清楚。因此，我們研究了大GTP酶Dynamin在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂中的作用。首先，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，Dynamin定位于紡錘體周圍并與微絲共定位;通過顯微注射干擾RNA或抑制劑處理來敲低Dynamin的表達或干擾其活性，可導致第一極體排出失敗;經(jīng)免疫熒光染色觀察和活細胞工作站觀測發(fā)現(xiàn)，干擾了Dynamin的活性后，

8、紡錘體遷移異常、染色體不能精準分離，細胞膜及胞質中的微絲信號強度顯著降低;另外，用抑制劑干擾Dynamin的蛋白活性后Profilin和Arp2/3復合物的表達顯著降低。因此，該試驗表明，Dynamin2-Profilin-Arp2/3-微絲通路對于小鼠卵母細胞中紡錘體的遷移和極體排出十分重要。
　　試驗二、大GTP酶Dynamin2影響小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的微絲分布
　　我們的研究已證明Dynamin能夠調控微絲介導的卵