胚胎干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染及Rac1在胚胎發(fā)育早期血管形成中的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景及目的: 目前冠心病治療領(lǐng)域最受關(guān)注的新理論和方法是治療性血管新生，其根據(jù)血管發(fā)育原理通過(guò)刺激心肌缺血區(qū)小血管生長(zhǎng)和側(cè)支循環(huán)形成達(dá)到改善心肌缺血的目的，代表著冠心病治療的新方向。胚胎干細(xì)胞（ESCs）是早期胚胎經(jīng)體外分化建立的多能性細(xì)胞系，體外培養(yǎng)時(shí)保持未分化狀態(tài)，可以傳代增殖。ESCs具有與早期胚胎細(xì)胞相似的分化潛能和正常整倍體核型兩大特點(diǎn)，是研究哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)育、胚胎分化以及性狀遺傳機(jī)制的理想模型?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)是將具

2、有生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能，進(jìn)而應(yīng)用于基因組功能研究（基因表達(dá)調(diào)控、基因功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物篩選研究）和基因治療研究。在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，ESCs是公認(rèn)的研究基因轉(zhuǎn)移、基因定位整合的一類極有前途的實(shí)驗(yàn)材料，但實(shí)際操作中ESCs外源基因轉(zhuǎn)染方法不夠統(tǒng)一，轉(zhuǎn)染效率差異較大，陽(yáng)性克隆篩選標(biāo)準(zhǔn)不一致。在體外培養(yǎng)條件下，ESCs于成纖維細(xì)胞形成的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)在白血病抑制因子（LIF）存在時(shí)，能夠維持全能干細(xì)胞的分化

3、特性。剔除上述因素后，ESCs可以自發(fā)地分化成單層細(xì)胞并聚集生長(zhǎng)成胚胎小體（Ebs）。Ebs模型可以模擬胚胎早期發(fā)育過(guò)程，其結(jié)合基因轉(zhuǎn)染技術(shù)成為血管發(fā)育生物學(xué)的一種重要研究工具。RhoA、Rac1和Cdc42是目前研究最多的Rho家族成員，Rho GTP酶可以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但對(duì)血管發(fā)育早期成血管細(xì)胞的增生和分化中的作用還所知甚少。本研究針對(duì)小鼠ESCs在不同飼養(yǎng)層細(xì)胞上的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察，并針對(duì)外源基因轉(zhuǎn)染小鼠ESCs的不同方

4、法進(jìn)行比較，探討小鼠ESCs外源基因轉(zhuǎn)染方法的可行性和有效性。同時(shí)通過(guò)成功轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+Rac1G12V及pcDNA3.1+Rac1T17N質(zhì)粒的ESCs株所建立的體外發(fā)育Ebs模型，探討血管發(fā)育早期Rac1在成血管細(xì)胞來(lái)源、血管形成過(guò)程中的調(diào)控作用和血管分化的變化規(guī)律，為進(jìn)一步闡明血管成熟、血管重塑及冠心病治療性血管新生奠定基礎(chǔ)。 材料與方法: 1. 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠ESCs株R1（ATCC）培養(yǎng)于絲裂

5、霉素（10mg/L，2h）處理后的飼養(yǎng)層細(xì)胞STO（小鼠成纖維細(xì)胞株，ATCC）或MEF（本室制備）上。ESCs在生長(zhǎng)到亞融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代，每天換液以維持其未分化狀態(tài)。 2. 載體構(gòu)建 pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V 質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增、測(cè)序、酶切線性化并回收純化。將更換為PGK 啟動(dòng)子的pEGFP-C1 以及pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V 質(zhì)粒行

6、KpnⅠ/ApaⅠ雙酶切，目的片斷回收后，行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取新構(gòu)建質(zhì)粒pPGK-Rac1G12V 和pPGK-Rac1T17N，酶切鑒定并送測(cè)序。 3. ESCs轉(zhuǎn)染 用電穿孔法將線性化的pcDNA3.1+Rac1T17N、pcDNA3.1+Rac1G12V載體轉(zhuǎn)染到ESCs R1細(xì)胞。按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，將pPGK-Rac1G12V和pPGK-Rac1T17N質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到

7、ESCs R1細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的ESCs在含G418的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)和篩選。將擴(kuò)增后10d的轉(zhuǎn)基因ESCs于解剖顯微鏡下用Pasteur槍頭挑取1.5～2mm的細(xì)胞克隆行擴(kuò)增培養(yǎng)。 4. 基因組PCR鑒定 應(yīng)用Taq PCR試劑盒行基因組DNA PCR分析。所擴(kuò)增片段為pcDNA3.1+載體中neomycin的cDNA序列。 5. ESCs分化及Ebs模型的建立 ESCs培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，用0.25

8、％胰酶及0.53mmol/L EDTA消化后，鋪于明膠包被的培養(yǎng)皿中，3h后大部分STO細(xì)胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為不含LIF的ESCs培養(yǎng)液。懸浮培養(yǎng)后6d，將Ebs接種于0.1％明膠鋪被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，每天換液。 6. 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 固定的Ebs經(jīng)0.05 mol/L TBS洗滌后，在含0.25％Triton X-100和0.5 mol/L NH4Cl的TBS中通透20m

9、in。正常山羊血清封閉1h后，與一抗在4℃孵育過(guò)夜?？剐∈罂贵w包括Rac1、CD31、SM α-actin及Caspase-3。 二抗為四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）或異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記抗體。 7. RT-PCR 參照說(shuō)明書用Trizol 提取不同時(shí)間點(diǎn)Ebs 中的RNA。取RNA1μg 進(jìn)行以下物質(zhì)的半定量PCR：CD31、SM α-actin 及GAPDH。 8. SDS-PAG

10、E電泳及Western blot分析 通過(guò)PULL DOWN分析來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ESCs、Ebs中Rac1的表達(dá)活性。將收集的不同活性Rac1蛋白或其他蛋白，分別行12％SDS-PAGE電泳。一抗4℃雜交過(guò)夜，二抗（HRP標(biāo)記的IgG）室溫雜交2h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，于暗室條件下壓X光片。 結(jié)論: 轉(zhuǎn)染Rac1 不同調(diào)控型質(zhì)粒建立Ebs 模型，可以模擬胚胎發(fā)育早期血管發(fā)育過(guò)程，觀察Rac1 在其中的調(diào)控