農(nóng)桿菌介導甜蛋白Brazzein基因轉(zhuǎn)化‘章姬’草莓的研究.pdf

1、草莓(Fragaria×ananassa Duch.)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，是世界上廣泛栽培的重要經(jīng)濟果樹。隨著人們生活水平的不斷提高，消費者對草莓果實品質(zhì)的要求逐漸提高?，F(xiàn)代基因工程直接在基因水平上進行改良，打破了物種間的界限，在培育抗病、抗蟲、抗逆境和抗除草劑等草莓優(yōu)良品種中發(fā)揮越來越重要的作用。自開展草莓轉(zhuǎn)基因研究以來，在草莓導入了多種有經(jīng)濟價值的外源目的基因。植物甜蛋白Brazzein已經(jīng)在多種高等植物中實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，但是表

2、達效果不盡相同，本實驗的目的就是在前人研究的基礎上，根據(jù)甜味蛋白Brazzein基因序列及其表達特性，通過重疊延伸PCR方法克隆了該基因全長并構(gòu)建植物雙元表達載體，采用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入草莓中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)Brazzein基因的53氨基酸序列和雙子葉植物對遺傳密碼子的偏愛性設計引物，利用重疊PCR法合成了Brazzein基因全長并在Brazzein全長基因的5'端添加黃花梨防御素基因PpyDF

3、N1信號肽，（GenBank登錄號為HM044853），對該基因進行了修飾，同時構(gòu)建了植物雙元表達載體PYH4215-Bra。該載體含有GUS報告基因和潮霉素Hyg抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（htp），T-DNA區(qū)三個外源基因均由CaMV35S啟動子控制。該載體導入農(nóng)桿菌菌株EHA105用于‘章姬’草莓遺傳轉(zhuǎn)化。
　　 2.以‘章姬’草莓試管苗葉片為外植體，采用農(nóng)桿菌介導法對草莓的遺傳轉(zhuǎn)化體系進行了研究。研究了菌液濃度、菌液侵染

4、時間、共培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮濃度、預培養(yǎng)時間、潮霉素濃度、羧芐青霉素等因素對草莓遺傳轉(zhuǎn)化的影響，建立了高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果顯示，菌液濃度OD600=0.4-0.5，根據(jù)菌液濃度的大小適當調(diào)節(jié)侵染時間，侵染時間6-8 min較適宜。共培養(yǎng)時間3d后直接轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，篩選暗14d后轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)效果較好，適宜的潮霉素濃度為4 mg/L，羧芐青霉素濃度為200mg/L。活化農(nóng)桿菌菌體時不需添加乙酰丁香酮。
　　 3.利用GUS

5、組織化學染色對124株抗性芽進行了檢測，有58株抗性芽表現(xiàn)為GUS陽性，陽性率為46.8％;利用PCR和RT-PCR法對‘章姬’草莓的13株GUS陽性株進行了檢測，獲得了8株草莓轉(zhuǎn)基因植株，編號分別為Bra-1-Bra-8。
　　 4.以4個‘章姬’草莓轉(zhuǎn)基因株系為實驗材料，對果實品比、可溶性固性物含量和可溶性糖含量的測定結(jié)果表明:4個轉(zhuǎn)基因株系中，Bra-3株系果實明顯比其他株系果實甜度高，可溶性固形物含量達到21.33，顯著