高溫脅迫下甘藍(lán)型油菜發(fā)育種子相關(guān)基因的差異表達(dá)研究.pdf

1、甘藍(lán)型油菜是我國乃至全世界重要的油料作物。隨著氣候變暖趨勢的不斷發(fā)展，油菜成熟期“高溫逼熟”現(xiàn)象越來越大地影響油菜的產(chǎn)量和質(zhì)量。本試驗(yàn)就甘藍(lán)型油菜在成熟期經(jīng)常發(fā)生的高溫逼熟現(xiàn)象展開研究，在基因表達(dá)水平上探索高溫脅迫引起的基因差異表達(dá)，以期初步探索高溫脅迫影響甘藍(lán)型油菜品質(zhì)性狀在表達(dá)水平的差異，從而為將來的育種工作打下良好的基礎(chǔ)。本研究以2007年21個(gè)農(nóng)藝性狀整齊的甘藍(lán)型油菜的高世代純合自交系作為實(shí)驗(yàn)材料，在自動(dòng)控制的溫室中作常溫和高溫

2、模擬控制試驗(yàn)。控制兩組平行材料分別種植在兩個(gè)同樣構(gòu)造的小溫室中，每份材料各種植40株，設(shè)兩個(gè)重復(fù)。溫室采用人工控制溫度、光照、濕度、水肥等生長條件，兩個(gè)溫室環(huán)境控制除溫度以外一律相同。在角果期(花后20天)對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行高溫脅迫處理。 ㈠采集花后30天物質(zhì)合成正處于高峰期的幼嫩的種子作為差異顯示的材料。種子成熟后，收集各株系種子測定其含油量、蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量、以及千粒重；通過分析篩選出高溫敏感型甘藍(lán)型油菜株系R54、R64

3、和R65和高溫鈍感型的甘藍(lán)型油菜R51、R60、R67和R69。 ㈡選取高溫敏感(R54)和高溫鈍感株系(R60)的甘藍(lán)型油菜各一個(gè)株系的花后30天的種子提取RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用AseⅠ和TaqⅠ兩種限制性內(nèi)切酶消化，連接接頭后利用cDNA—AFLP法從256對特異擴(kuò)增引物組合擴(kuò)增出的基因表達(dá)片段中找到5組穩(wěn)定重復(fù)出現(xiàn)的差異表達(dá)片段；回收、測序并在NCBI基因庫中比對分析。其中有3組實(shí)驗(yàn)所得片段在基因庫中可以找到序列

4、同源片段，這些片段可能反映油菜在高溫脅迫下的差異表達(dá)。其中一組與擬南芥某蛋白酶結(jié)構(gòu)域的序列同源，一組與甘藍(lán)型油菜的線粒體基因組DNA序列同源，另外一組暫時(shí)沒有與其相關(guān)功能的報(bào)道。用2008年材料做RT—PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所得差異片段在高溫影響脅迫下表達(dá)量相對下調(diào)。 ㈢前人對熱激蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白HSP70也在線粒體中發(fā)揮作用。線粒體是生物體內(nèi)能量代謝的最主要的細(xì)胞器，所以推測本實(shí)驗(yàn)所得與甘藍(lán)型油菜線粒體基因組同源的片

5、段可能在線粒體對高溫脅迫的反應(yīng)過程中特異表達(dá)，協(xié)同熱激蛋白的合成，共同調(diào)節(jié)和應(yīng)對高溫脅迫作用，而且可能與植物體在高溫脅迫下的能量代謝相關(guān)。另外一組與擬南芥某蛋白酶序列同源，蛋白酶參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝；可能與熱激蛋白的代謝過程和作用機(jī)制有關(guān)。還有一組其具體的作用機(jī)理還不明確。盡管要詳細(xì)說明甘藍(lán)型油菜感受高溫時(shí)的反應(yīng)機(jī)理和過程還需進(jìn)一步的研究，但本研究所獲差異表達(dá)片段能在一定程度反映高溫脅迫下甘藍(lán)型油菜的基因的差異表達(dá)，其序列信息對植物在高