甘藍型油菜裂角相關基因bnrpl的克隆與分析

1、中國油料作物學報ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｉｌＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓ２０１３，３５（１）：０１７－０２３ｄｏｉ：１０７５０５／ｊｉｓｓｎ１００７－９０８４２０１３０１００３甘藍型油菜裂角相關基因ＢｎＲＰＬ的克隆與分析彭鵬飛，胡瓊，李云昌，付麗，陳玉峰，劉佳，梅德圣（中國農業(yè)科學院油料作物研究所，農業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，湖北武漢，４３００６２）摘要：為鑒定甘藍型油菜裂角相關基因，基于候選基因途徑，利用同源克隆

2、結合ＲＡＣＥ方法，在甘藍型油菜易裂角品系Ｒ２中擴增出了兩個ＲＰＬ基因的全長ｃＤＮＡ序列，其中一條序列長度為２０６８ｂｐ，開放閱讀框序列位置為１５４－１９１１位，總長為１７５８ｂｐ，命名為ＢｎＲＰＬａ。另一條序列全長為２０４１ｂｐ，開放閱讀框序列位置為１５４－１８８７位，總長為１７３４ｂｐ，命名為ＢｎＲＰＬｃ。分析表明利用ＰＣＲ方法得到的ＢｎＲＰＬ基因由３個內含子和４個外顯子組成，與擬南芥ＲＰＬ基因結構相似。氨基酸序列同源性分析表明，Ｂｎ

3、ＲＰＬ與擬南芥ＡｔＲＰＬ和荒野獨行菜（Ｌｅｐｉｄｉｕｍｃａｍｐｅｓｔｒｅ）的ＲＰＬ具有較高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示ＲＰＬ蛋白在雙子葉植物和單子葉植物的分化過程中發(fā)生了序列變異。ＢｎＲＰＬ基因存在時空表達的組織特異性，在發(fā)育的角果（花后２０ｄ）表達量最大；成熟后期在角果皮和假隔膜中表達，在種子中不表達。關鍵詞：油菜；角果皮；假膈膜；ＲＰＬ基因；ＲＡＣＥ；序列分析；表達中圖分類號：Ｓ５６５４０３文獻標識碼：Ａ文章編號：１００７－９０８

4、４（２０１３）０１－００１７－０７ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｐｏｄｓｈａｔｔｅｒｉｎｇｇｅｎｅＢｎＲＰＬｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＰＥＮＧＰｅｎｇ－ｆｅｉ，ＨＵＱｉｏｎｇ，ＬＩＹｕｎ－ｃｈａｎｇ，ＦＵＬｉ，ＣＨＥＮＹｕ－ｆｅｎｇ，ＬＩＵＪｉａ，ＭＥＩＤｅ－ｓｈｅｎｇ（ＯｉｌＣｒｏｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＫｅｙＬ

5、ａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＯｉｌＣｒｏｐｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｕｈａｎ４３００６２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｏｆａｐｕｔａｔｉｖｅｐｏｄｓｈａｔｔｅｒｉｎｇｇｅｎｅＢｎＲＰＬｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｌｉｎｅＲ２（ｅａｓｙｔｏｄｉｓｐｅｒｓｅｓｅｅｄ）ｂｙＲＡＣＥａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｃｏｎｓ

6、ｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆＡｔＲＰＬｇｅｎｅＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｗｏＢｎＲＰＬｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｎａｍｅｄａｓＢｎＲＰＬａ［ｗｉｔｈａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ１７５８ｂｐ，ｃｏｄｉｎｇ５８５ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ］ａｎｄＢｎＲＰＬｃ（ｗｉｔｈａｎＯＲＦｏｆ１７３４ｂｐ，ｃｏｄｉｎｇ５７７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）ＥａｃｈＢｎＲＰＬｓｉｎｃｌｕｄｅｄ３ｉｎｔｒｏｎｓａｎｄ４ｅｘｏｎｓＢｎＲＰＬ

7、ａａｎｄＢｎＲＰＬｃｗａｓ９２％ｉｄｅｎｔｉｃａｌＣｏｍｐａｒｉｎｇｔｏＲＰＬｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ，ＢｎＲＰＬｓｈｏｗｅｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｔｏＡｔＲＰＬｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄＲＰＬｆｒｏｍＬｅｐｉｄｉｕｍｃａｍｐｅｓｔｒｅＶａｒｉａｔｉｏｎｏｆＲＰＬｐｒｏｔｅｉｎｏｃｃｕｒｒｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｆｒｏｍｄｉｃｏｔｓａｎｄｍｏｎｏｃｏｔｓＲＴ

8、－ＰＣＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｎＲＰＬｇｅｎｅｗａｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｓｉｌｉｑｕｅｓ（２０ｄａｆｔｅｒｂｌｏｏｍｉｎｇ）Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｉｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｍａｔｕｒｉｎｇｓｉｌｉｑｕｅｗａｌｌａｎｄｐｓｅｕｄｏｓｅｐｔｕｍ，ｂｕｔｎｏｔｉｎｓｅｅｄｓＫｅｙｗｏｒｄｓ：ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ；Ｓｉｌｉｑｕｅｗａｌｌ；Ｐｓｅｕｄｏｓｅｐｔｕｍ；ＲＰ

9、Ｌｇｅｎｅ；ＲＡＣＥ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎａｌｙｓｉｓ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ收稿日期：２０１２１００７基金項目：國家產業(yè)技術體系（ＣＡＲＳ－１３）；國家科技支撐計劃（２０１１ＢＡＤ１０Ａ１０４）；湖北省研究與開發(fā)項目（２０１１－２０１５）作者簡介：彭鵬飛（１９８４－），男，博士研究生，研究方向油菜分子育種通訊作者：梅德圣（１９７１－），男，副研究員，博士，從事油菜遺傳育種研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｓｈｅｎｇｍｅｉ＠ｈｏｔｍａｉｌ

10、ｃｏｍ角果開裂在植物界廣泛存在，是繁衍的一種形式，對植物后代的繁殖和進化具有重要意義，但角果開裂卻給收獲籽實的農業(yè)生產帶來了損失［１］。油菜的裂角是造成油菜減產的主要原因之一，也是目前實現(xiàn)機械化收獲急需解決的首要問題。因此，提高油菜品種的抗裂角能力對于生產實際具有重要意義。當前國內油菜抗裂角研究較少，有限的研究主要集中在抗裂角種質的篩選［２］和影響角果開裂相關因素的分析上［３］?？沽呀切苑N質資源的短缺嚴重制約著抗裂角性油菜品種的遺傳改良

11、，創(chuàng)造和培育抗裂角的新種質非常重要。國內外對模式植物擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）連接后克隆測序。１５甘藍型油菜ＢｎＲＰＬ的組織特異性表達分析在植株生長期間，分別提取根、莖、葉、幼小花蕾和發(fā)育的角果（花后２０ｄ）以及花器官中的雄蕊和柱頭，即將成熟角果中的角果皮、種子與假隔膜的總ＲＮＡ，反轉錄成ｃＤＮＡ后，采用Ｃｈａｉ等［１３］的半定量法檢測ＢｎＲＰＬ在不同組織中的相對表達量。以甘藍型油菜的看家基因Ａｃｔｉｎ（ＧｅｎＢａ

12、ｎｋ登錄號ＡＦ１１１８１２２）為內參基因進行半定量ＰＣＲ分析，采用的引物組合為ＲＰＬ－Ｆ－２２５（５’－ＣＧＡＴＴＣＣＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣ－３’）和ＲＰＬ－Ｒ－６５５（５’－ＧＡＡＴＧＧＡＴＧＣＧＴＡＧＣＣＴＧＴＧ－３’）、Ａｃｔｉｎ－Ｆ（５’－ＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’）和Ａｃｔｉｎ－Ｒ（５’－ＣＡＧＧＧＡＡＣＡＴＧＧＴＣＧＡＡＣＣＡＣＣ－３’）。１６ＢｎＲＰＬ基因全長序列的ＰＣＲ擴增為明

13、確甘藍型油菜ＢｎＲＰＬ基因結構，參考擬南芥的ＡｔＲＰＬ基因組序列，分兩段擴增甘藍型油菜ＢｎＲＰＬ的基因組序列。以拼接得到的ＢｎＲＰＬａ基因ｃＤＮＡ序列分段設計引物進行基因組ＤＮＡ序列擴增，引物分別為：ＲＰＬ－７０（５’－ＧＴＴＴＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＡＴＴＡＴ－３’）、ＲＰＬ－１２７８－Ｒ（５’－ＴＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＡ－３’）、ＲＰＬ－１２７８－Ｆ（５’－ＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＴＧＧＣＴＡ－３’）

14、和ＲＰＬ－１８４４（５’－ＧＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＣＣＣＴＣＡＴＣ－３’）。以基因組ＤＮＡ為模板分段擴增ＢｎＲＰＬ基因的全長序列，反應條件為：９５℃，３ｍｉｎ；９４℃，４５ｓ；５０℃，４５ｓ；７２℃，２ｍｉｎ；３４個循環(huán)；最后再７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ產物用１２％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收所得片段進行克隆和測序。２結果與分析２１ＢｎＲＰＬ基因ｃＤＮＡ的克隆利用保守區(qū)段設計引物在Ｒ２的ｃＤＮＡ中擴增出了一條４８３ｂｐ的條帶（圖１Ａ）。該

15、條帶經測序后提交ＧｅｎＢａｎｋ進行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)克隆得到的核苷酸片段與擬南芥ＲＰＬ基因（ＡＴ５Ｇ０２０３０）１２１０－１６９２ｂｐ區(qū)段上的序列具有非常高的相似性，在Ｅ值為９ｅ－１４９的情況下，核苷酸序列的一致性達到８２％，表明此片段可能為甘藍型油菜ＲＰＬ基因的部分序列。根據ＰＣＲ擴增得到的油菜ＲＰＬ基因片段序列，按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ說明書的ＰＣＲ程序進行５’ＲＡＣ

16、Ｅ和３’ＲＡＣＥ擴增，擴增產物使用１２％的瓊脂糖凝膠電泳進行分離。結果顯示，３’ＲＡＣＥ擴增出了比較單一的條帶，片段的大小為９００ｂｐ左右（圖１Ｂ），而５’ＲＡＣＥ擴增出了兩條比較明顯的條帶，大小分別為１２００與１７００ｂｐ左右（圖１Ｂ）。每條ＰＣＲ擴增產物測序后進行ｂｌａｓｔ比對。結果表明３’ＲＡＣＥ產物由兩類同源性較高的序列組成，ＮＣＢＩ基因序列庫比對表明兩類序列都屬于擬南芥ＡｔＲＰＬ（ＡＴ５Ｇ０２０３０）基因的同源序列。５’ＲＡＣ

17、Ｅ的兩個片段中，小片段序列與擬南芥的ＡｔＲＰＬ序列沒有同源性，屬于非特異性擴增；長片段屬于擬南芥ＡｔＲＰＬ的同源序列。由于５’ＲＡＣＥ與３’ＲＡＣＥ引物的擴增產物中有４９１ｂｐ的重疊序列，用ＣｏｎｔｉｇＡｓｓｅｍｂｌｙＰｒｏｇｒａｍ３（ＣＡＰ３）序列拼接軟件對５’ＲＡＣＥ序列和３’ＲＡＣＥ的兩類序列進行全長拼接，得到了兩條長度不同的全長ｃＤＮＡ序列。其中一條序列長度為２０６８ｂｐ，經ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ軟件分析表明其開放讀碼框（ＯＲＦ）序

18、列位置為１５４－１９１１位，總長為１７５８ｂｐ，命名為ＢｎＲＰＬａ。另一條序列全長為２０４１ｂｐ，ＯＲＦ序列位置為１５４－１８８７位，總長為１７３４ｂｐ，命名為ＢｎＲＰＬｃ。序列比對表明ＢｎＲＰＬａ與ＢｎＲＰＬｃ具有較高的同源性，其ＯＲＦ序列的一致性達到９５％，主要變異集中在３’端。ＢｎＲＰＬａ和ＢｎＲＰＬｃ與擬南芥ＡｔＲＰＬ序列都具有較高的同源性，其ＯＲＦ序列的一致性分別為８４％和８５％。注：Ａ：保守區(qū)段擴增；Ｂ：３’和５’ＲＡＣＥ結

19、果，Ｍ為分子量標記，１為保守片段的ＰＣＲ結果，２為３’ＲＡＣＥ結果，３為５’ＲＡＣＥ結果Ｎｏｔｅ：Ａ，ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＰＬｇｅｎｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｆｒａｇｍｅｎｔ；Ｂ，ＰＣＲｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ３’－ＲＡＣＥａｎｄ５’－ＲＡＣＥ，Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ１：ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＰＬｇｅｎｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｆｒａｇｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ２：ＰＣＲｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ３’－ＲＡＣＥ；Ｌａｎｅ３：ＰＣＲ

20、ｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ５’－ＲＡＣＥ圖１ＢｎＲＰＬ基因ｃＤＮＡ序列克?。疲椋纾保茫欤铮睿椋睿纾铮妫拢睿遥校蹋妫颍铮恚拢睿幔穑酰螅悖模危粒玻玻拢睿遥校痰男蛄蟹治雠c系統(tǒng)發(fā)育樹構建ＢｎＲＰＬａ基因的全長ｃＤＮＡ序列，經ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ軟件分析表明其ＯＲＦ總長為１７５８ｂｐ，編碼５８５個氨基酸，所編碼的蛋白質理論分子量為６２８４ｋＤ，等電點為６８０。ＢｎＲＰＬｃ基因的ＯＲＦ序列長度為１７３４ｂｐ，編碼５７７個氨基酸，理論分子量為６２１２ｋＤ