甘藍(lán)型油菜應(yīng)答干旱脅迫的組學(xué)研究.pdf

1、油菜是重要的油料作物，在早期營養(yǎng)生長階段對水分的缺失尤為敏感。為了闡明甘藍(lán)型油菜應(yīng)答干旱脅迫的分子機理，本研究以干旱敏感程度不同的甘藍(lán)型油菜2AF009、3DH020和2AF410為實驗材料，系統(tǒng)調(diào)查了甘藍(lán)型油菜在干旱脅迫下的生理生化變化及分子應(yīng)答機制，構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜耐旱的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、挖掘抗旱相關(guān)的基因并進(jìn)行功能驗證。主要研究結(jié)果下:
　　1.甘藍(lán)型油菜響應(yīng)干旱脅迫的生理生化變化
　　在干旱脅迫下，甘藍(lán)型油菜2AF009比2

2、AF410和3DH020失水速率更慢，相對含水量降低的更少，脯胺酸含量積累的更多，葉綠素a和b的含量更高。試驗數(shù)據(jù)表明，2AF009比2AF410和3DH020具備更強的干旱適應(yīng)能力。因此，選取2AF009進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究。
　　2.甘藍(lán)型油菜在干旱脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組分析
　　利用RNA-seq技術(shù)對干旱處理組和對照組的油菜葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組比較分析，共篩選出7379個顯著差異表達(dá)的基因，其中包括3072個上調(diào)表達(dá)

3、基因和4307個下調(diào)表達(dá)基因。COG功能分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因共可歸為25類，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因數(shù)量最多，其次是與碳代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及翻譯后修飾相關(guān)的基因。GO分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在與脅迫響應(yīng)、磷代謝、激素刺激以及滲透脅迫響應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)過程，亞細(xì)胞定位主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。KEGG分析表明，差異基因共參與到55條顯著代謝通路，包括淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物晝夜節(jié)律、苯丙氨酸生物合成、谷胱甘肽代謝等途徑，這些都是與甘藍(lán)

4、型油菜干旱脅迫響應(yīng)密切相關(guān)的代謝途徑。鑒定了292個編碼轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄本，包括MYB、bHLH、NAC、WRKY、 AP2-EREBP、bZIP、HSF等轉(zhuǎn)錄因子家族基因成員被大量的誘導(dǎo)表達(dá)。表明上游調(diào)控元件參與了干旱脅迫的響應(yīng)。
　　3.甘藍(lán)型油菜應(yīng)答干旱脅迫的比較蛋白組學(xué)分析
　　利用熒光差異雙向電泳(two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)結(jié)合質(zhì)譜技

5、術(shù)對不同程度干旱脅迫下的油菜葉片進(jìn)行比較蛋白組學(xué)分析，共鑒定了138個干旱應(yīng)答的差異豐度蛋白點，代表98種不同的蛋白。其中，輕度干旱脅迫鑒定了85個蛋白，重度干旱脅迫鑒定了107個蛋白。功能分析顯示，干旱應(yīng)答蛋白大部分與翻譯后修飾、能量代謝和碳水化合物有關(guān)，主要定位在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)上。值得注意的是，其中35個蛋白點鑒定了20種不同的蛋白，每種蛋白包含了2到8個等電點和分子量不同的蛋白點，可能是由于蛋白異構(gòu)型或者翻譯后修飾造成的，βCA1

6、是一類數(shù)量最多的蛋白，包含了相同分子量不同等電點的8個蛋白點。利用定量PCR技術(shù)分析甘藍(lán)型油菜蛋白的基因表達(dá)規(guī)律發(fā)現(xiàn)，部分干旱應(yīng)答蛋白的表達(dá)豐度與其基因水平上的表達(dá)變化密切相關(guān)，表明這部分基因在干旱處理后其表達(dá)調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。而一些蛋白在干旱處理后其表達(dá)變化規(guī)律與其轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化完全不同，可能是翻譯后修飾在調(diào)控這些基因的功能中發(fā)揮重要作用。
　　4.甘藍(lán)型油菜應(yīng)答干旱脅迫的磷酸化蛋白組學(xué)分析
　　為獲得甘藍(lán)型油菜應(yīng)

7、答干旱脅迫的磷酸化修飾信息，提取了不同干旱處理的甘藍(lán)型油菜葉片總蛋白，酶解后進(jìn)行磷酸化肽段富集和LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定。最終鑒定了4469個磷酸化肽，來自1232個磷酸化蛋白。以|log2Ratio≥1且p＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異磷酸化蛋白的篩選，共鑒定了磷酸化水平上具有顯著差異的337個磷酸化蛋白和547個磷酸化位點。其中，226個磷酸化蛋白是應(yīng)答輕度干旱脅迫，268個是應(yīng)答重度干旱脅迫。功能分析表明，顯著差異的磷酸化蛋白主要富集在

8、非生物脅迫刺激和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程，具有蛋白激酶活性或磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。COG功能分類結(jié)果顯示，甘藍(lán)型油菜中大部分的差異磷酸化蛋白功能未知，需要進(jìn)一步研究。整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的KEGG途徑分析發(fā)現(xiàn)淀粉和蔗糖代謝途徑在差異基因、差異蛋白和差異磷酸化蛋白中富集，共包括淀粉合成酶、淀粉酶、海藻糖磷酸合成酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶和葡萄糖磷酸變位酶11個酶。這些酶可能是通過磷酸化修飾作用協(xié)調(diào)植物在受到干旱脅迫時的代謝過程和生理生化反應(yīng)。

9、r>　　5.βCA1的綜合分析
　　在mRNA水平，βCA1基因在干旱處理下上調(diào)表達(dá)。在蛋白水平，8個不同βCA1的蛋白點應(yīng)答干旱脅迫時表達(dá)不一致。翻譯后修飾水平上，βCA1蛋白的Tyr207在干旱誘導(dǎo)下發(fā)生去磷酸化修飾。對碳酸酐酶的活性測定發(fā)現(xiàn)，干旱處理下碳酸酐酶的活性降低，與βCA1在Tyr207位點的去磷酸化修飾程度一致。這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)活性和磷酸化修飾之間似乎有著很強的相關(guān)性，暗示著βCA1可能通過磷酸化修飾調(diào)整酶活性最

10、終協(xié)調(diào)植物的代謝過程從而適應(yīng)干旱脅迫。通過同源性建模構(gòu)建了βCA1的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)磷酸化位點Tyr207位于底物結(jié)合活性中心。表明Tyr207磷酸化/去磷酸化的變化可能影響碳酸酐酶和底物的結(jié)合能力。由此得出，Tyr207可能是影響碳酸酐酶活性的重要的磷酸化位點。通過NCBI序列比對發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥中的At3g1500同源性最高。
　　6.干旱脅迫條件下擬南芥βCA1突變體的表型觀察
　　觀察干旱脅迫下突變體的表型發(fā)現(xiàn)，對比