黃瓜葉片衰老過程中內(nèi)肽酶變化及其生化特性的研究.pdf

1、葉片衰老是葉片生長發(fā)育過程中一個重要階段，該期間蛋白質(zhì)的降解是葉片衰老過程中一個極其重要的事件，蛋白質(zhì)降解后的營養(yǎng)物質(zhì)會運送到生長旺盛的組織或貯藏器官被再利用對后者的生長具有重要意義；另一方面葉片蛋白質(zhì)，尤其Rubisco的降解影響光合作用的進(jìn)行，對生物產(chǎn)量的形成和提高造成不良影響。因此研究和弄清葉片蛋白質(zhì)降解機(jī)制具有重要的意義。許多研究認(rèn)為內(nèi)肽酶在葉片蛋白質(zhì)降解中起主要作用，但不同植物中內(nèi)肽酶種類、特性等存在差異，因此深入研究不同植物

2、中內(nèi)肽酶變化規(guī)律及其功能對揭示蛋白質(zhì)降解機(jī)制有重要作用。黃瓜是我國栽培面積較大的蔬菜作物，由于黃瓜為無限生長植物，在生產(chǎn)中葉片早衰是影響黃瓜產(chǎn)量的重要因素，因此，延緩黃瓜葉片衰老無疑將顯著增加其產(chǎn)量。但國內(nèi)對黃瓜葉片衰老的研究主要集中在光合特性變化和栽培措施等方面，對其衰老機(jī)制尤其是葉片蛋白質(zhì)降解與內(nèi)肽酶的關(guān)系研究則幾乎未見報道。本文研究了黃瓜葉片衰老過程中的主要生理生化特性變化，并重點對葉片蛋白質(zhì)降解及其內(nèi)肽酶同工酶變化及其生化特性等

3、進(jìn)行了研究，結(jié)果表明： 黃瓜葉片衰老過程中，葉片的葉綠素含量、凈光合速率、蛋白質(zhì)含量和SOD活性降低，但MDA含量和POD活性增加；葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，外形由長橢圓形逐漸趨于圓形；葉綠體內(nèi)淀粉粒由多而大逐漸變少而小，油脂則由小而少變大而多；基粒片層由細(xì)長沿葉綠體長軸方向排列，逐漸變粗短，排列雜亂至模糊不清，內(nèi)含物向細(xì)胞中擴(kuò)散而最終導(dǎo)致葉綠體解體。因此葉片蛋白質(zhì)的降解可能與葉綠體結(jié)構(gòu)的變化和葉片內(nèi)的氧化脅迫增加有關(guān)。

4、為研究黃瓜葉片衰老過程中內(nèi)肽酶變化對可溶性蛋白質(zhì)降解的影響，采用以明膠為底物的梯度凝膠電泳活性染色方法，首次對自然衰老過程中黃瓜葉片內(nèi)肽酶同工酶的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，黃瓜葉片自然衰老過程中蛋白質(zhì)含量在葉片伸出后15天左右最高，隨后開始降低；內(nèi)肽酶活性在葉片伸出35d后顯著升高，此時葉片中蛋白質(zhì)明顯發(fā)生降解。黃瓜葉片內(nèi)肽酶的最適pH為7.0，最適溫度為40℃，內(nèi)肽酶活性可被Ca<'2+>、半胱氨酸等激活，內(nèi)肽酶抑制劑分析顯示絲氨酸類

5、型的內(nèi)肽酶活性占總活性的57％左右。梯度凝膠電泳活性染色方法檢測到至少4種黃瓜葉片內(nèi)肽酶同工酶，各同工酶活性變化和出現(xiàn)時期在自然衰老過程中不同；絲氨酸內(nèi)肽酶同工酶2，3隨葉片衰老活性增強，為黃瓜葉片中主要的內(nèi)肽酶同工酶。為進(jìn)一步了解黃瓜葉片衰老期間的各種內(nèi)肽酶同工酶變化及其生化特性，采用離體葉片暗誘導(dǎo)處理進(jìn)行試驗，結(jié)果表明，暗誘導(dǎo)使葉片衰老加速，葉綠素含量快速下降，葉片蛋白質(zhì)降解與內(nèi)肽酶活力升高呈負(fù)相關(guān)。應(yīng)用活性電泳方法檢測到了黃瓜葉片

6、暗誘導(dǎo)衰老過程中有9種內(nèi)肽酶同工酶(CEP1-9)，其中6種(CEP1， 5，6，7，8，9)與衰老進(jìn)程相關(guān)。而且，黃瓜葉片在自然衰老中出現(xiàn)的同工酶，在暗誘導(dǎo)衰老中也出現(xiàn)。對內(nèi)肽酶同工酶生化特性研究表明，各種同工酶在40℃時活性最高，適宜的pH為6.0-8.0；其中CEP3熱穩(wěn)定性最高。所檢測到的內(nèi)肽酶同工酶中，CEP2，3，4，9內(nèi)肽酶活性較強，為黃瓜葉片衰老中主要的內(nèi)肽酶，它們在pH5.0-9.0的范圍內(nèi)均有活性，最適pH為7.0；

7、溫度低于25℃或高于60℃各內(nèi)肽酶均沒有活性。蛋白酶抑制劑試驗分析表明，CEP2，3，4，9屬于絲氨酸型內(nèi)肽酶，CEP6為半胱氨酸型內(nèi)肽酶，因此認(rèn)為絲氨酸型內(nèi)肽酶在黃瓜葉片衰老中具有重要作用。 為深入了解黃瓜衰老葉片中活性最強的絲氨酸內(nèi)肽酶的生理作用，采用絲氨酸內(nèi)肽酶抑制劑AEBSF、ABA和GA處理的方法，研究了其對黃瓜葉片衰老的影響，結(jié)果表明，50μM 6-BA與絲氨酸內(nèi)肽酶抑制劑AEBSF處理不僅能抑制葉片內(nèi)肽酶活性的升高

8、、延緩葉片蛋白質(zhì)降解，而且能提高SOD活性，降低POD活性；而50 μM ABA則促進(jìn)了內(nèi)肽酶活性的升高；但50μ MABA+10mmol/L AEBSF處理后葉片內(nèi)肽酶活性低于單獨ABA處理?；钚噪娪撅@示，黃瓜葉片中檢測到6條內(nèi)肽酶同工酶，其中4條(CEP2，3，4，6)為絲氨酸型內(nèi)肽酶，內(nèi)肽酶抑制劑AEBSF抑制了葉片中絲氨酸內(nèi)肽酶同工酶的活性，而ABA使絲氨酸內(nèi)肽酶CEP2，3，4的活性顯著增強，再次暗示了絲氨酸型內(nèi)肽酶在黃瓜葉片

9、衰老以及葉片Rubisco降解中具有重要作用，而且除了絲氨酸內(nèi)肽酶外，可能還有其它因素參與了衰老的調(diào)控。 還應(yīng)用外源氮肥處理，研究了其對黃瓜葉片中蛋白質(zhì)降解與內(nèi)肽酶活性及同工酶變化的影響，以期了解N素對植物內(nèi)肽酶表達(dá)和活性表現(xiàn)的影響。結(jié)果表明，隨著葉面施氮濃度的提高，葉片蛋白質(zhì)含量增加、而內(nèi)肽酶活性減弱，在一定N濃度范圍內(nèi)，葉片生長正常，葉片沒有衰老癥狀。高氮處理間內(nèi)肽酶同工酶組成上變化不明顯，但在低氮處理中，內(nèi)肽酶同工酶活性增